小麦黄花叶病毒P1蛋白原核表达、抗血清制备及其检测

用RT-PCR方法从感染小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物的小麦叶片中扩增获得该病毒P1基因的全长cDNA片段,并进行了序列分析。结果表明,P1基因编码区含有765个核苷酸,编码1个由255氨基酸组成分子量为28.2 kDa的蛋白。将P1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中构建重组原核表达载体pGEX 6P-1-P1,经IPTG诱导,P1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-P1的融合蛋白,纯化并制备了P1蛋白的兔抗血清。利用此抗血清,可以检测WYMV病叶中的P1蛋白,但与提纯的WYMV粒子没有血清学反应,表明P1没有参与WYMV粒子的包装,是一种非结构蛋白。     

小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。     

壳寡糖诱导的烟草Ser/Thr蛋白激酶的原核表达纯化及多克隆抗体的特异性检测

将壳寡糖诱导烟草中的一个Ser/Thr激酶OIPKL基因的C端部分定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG可诱导融合蛋白高效表达,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经纯化得到纯度较高的融合蛋白。用纯化的融合蛋白GST-OIPKLc免疫家兔,可得到抗血清anti-OIPK。anti-OIPK抗血清能特异识别原核系统表达的抗原以及烟草自身的抗原,对烟草中的OIPKL和OIPK蛋白具有高度的特异性。     

小麦自噬标志分子ATG6的原核表达及其抗血清制备

克隆小麦(Triticum aestivum L.)品种‘洛夫林10’(L10)中的ATG6(动物同源物为Beclin1)基因,并构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,经纯化后制备其兔抗血清。结果表明:从小麦品种L10中克隆获得1个ATG6的片段,长为1326 bp,利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,实现了对ATG6片段在原核系统的特异性表达。经蛋白纯化后,制备了其兔抗血清并通过Western blot鉴定了其特异性。ATG6抗体制备的成功,为小麦中ATG6基因和自噬功能的研究提供了研究基础。     

香蕉线条病毒MP功能域基因的克隆、原核表达及抗血清制备

【目的】制备香蕉线条病毒广东分离物(BSV-GD)MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清,为BSV基因编码蛋白功能的研究提供条件.【方法】对BSV-GD ORF3基因氨基酸序列进行生物信息学分析,得出MP功能域基因序列,克隆该基因并插入载体pET-28b(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导表达后,采用超声波裂解法进行蛋白可溶性分析,利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的融合蛋白进行纯化和回收,然后以纯化的目的蛋白为抗原免疫健康家兔制备其多克隆抗血清;通过Western-blot分析该抗血清的特异性,间接ELISA法检测该抗血清的效价.【结果和结论】MP功能域基因在ORF3中的序列为61~311 aa处,核酸序列长753 bp.试验克隆了该基因并成功构建了其原核表达载体pET28b-MP,经IPTG诱导1 h后表达了相对分子质量约为30 800的融合蛋白6His·MP.可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在,纯化获得了高纯度的目的融合蛋白,以其为抗原成功制备了BSV-GD MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清;分析表明该抗血清具有很强的特异性,其效价高达204 800倍以上.     

小麦种子过氧化物酶基因wp1的克隆及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆小麦种子过氧化物酶基因wp1,并利用原核系统表达纯化。【方法】通过RT-PCR从小麦未成熟种子中扩增wp1基因cDNA,构建His-tag和MBP融合表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。使用直链淀粉亲和层析获得MBP-WP1融合蛋白,并以ABTS为底物检测酶活性。【结果】获得的wp1基因cDNA编码一种358个氨基酸残基的蛋白产物,其序列与大麦BP1相似性高达89%;空间结构预测结果表明,小麦WP1属于第三类过氧化物酶,具有该家族成员典型的血红素和钙离子结合位点;His-Tag融合的WP1主要以包涵体形式存在,而MBP融合的WP1主要以可溶形式存在,表达量分别达到总蛋白的18.2%和34.6%;纯化获得的MBP-WP1融合蛋白可检测到过氧化物酶活性。【结论】使用原核系统可高效表达出可溶性的、具有部分活性的WP1蛋白。     

番茄环纹斑点病毒非结构蛋白NSs的原核表达及多抗血清制备

用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功能奠定了基础。     

大豆24 kDa油体蛋白基因在大肠杆菌中的表达

 分别构建了含全长大豆24 kDa油体蛋白基因、与大肠杆菌热敏毒素B亚基和定居因子CS6 B亚基基因以串联方式融合的全长大豆24 kDa油体蛋白基因、缺失N端74个氨基酸编码序列的油体蛋白基因及缺失C端152个氨基酸编码序列油体蛋白基因等4个大肠杆菌表达载体。除N端缺失的油体蛋白基因外,其它3个载体的IPTG诱导表达产物对E.coli生长表现出明显的抑制作用,菌液浓度与对照菌株相比,至少降低了3倍;而N端缺失了222个编码核苷酸的油体蛋白基因则对宿主细菌细胞的生长繁殖不再表现有任何毒性。进一步通过SDS-PAGE和Western印迹反应检测各表达载体的IPTG诱导表达产物时发现,仅有N端缺失的24 kDa油体蛋白基因片段在宿主细胞BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中有重组油体蛋白积累。     

柞蚕丝蛋白基因3′端部分片段的克隆与表达

利用PCR的方法克隆了柞蚕丝素基因3′端588bp的部分片段，将该片段克隆到原核融合蛋白表达系统pGEX-6P上，IPTG诱导后经过SDS—PAGE和Western blot分析，表明融合蛋白得以在大肠杆菌中表达。     

鸡白介素18成熟肽基因原核表达及抗血清的制备

用PCR技术从含鸡IL-18全长基因质粒扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白基因，亚克隆于pPROEX^TM HTa原核表达载体上，重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5a中，随机筛选到阳性重组质粒，经酶切和测序证实目的基因止确克隆于表达载体。IPTG诱导，重组蛋白以包涵体形式表达。薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21．95％，用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白，免疫SPF鸡制备抗血清。Western blot结果显示鸡抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异结合。ELISA可以检测到较高的多克隆抗体效价，表明此蛋白具有良好的抗原性。     

马铃薯液泡蔗糖转化酶原核表达及多克隆抗血清的制备

马铃薯液泡蔗糖转化酶在马铃薯块茎低温糖化过程中起着关键作用。将马铃薯液泡蔗糖转化酶基因StVIN1的N端部分片段连接到原核表达载体pET-28a,将重组质粒pET-28a-StVIN1-N通过热激的方法转化到宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,经0.84 mmol/L IPTG诱导得到带有6×His标签的融合蛋白。以纯化后的蛋白为抗原免疫家兔,获得多克隆抗血清。利用得到的抗血清对纯化后的蛋白进行Western blot鉴定,结果表明所制备的多克隆抗血清具有良好的特异性。     

玉米ZmCIPK42原核表达载体构建及蛋白纯化

[目的]分析玉米ZmCIPK42序列,诱导蛋白表达,并获得纯化的蛋白.[方法]利用蛋白分析软件分析ZmCIPK42性质及磷酸化作用位点,构建ZmCIPK2-pET30a原核表达载体,用IPTG诱导蛋白表达,用NiNTA树脂纯化蛋白.[结果]ZmCIPK42具有典型的CIPK家族基因的N端激酶结构域和C端NAF调控域,激酶结构域内有较多磷酸化位点,原核表达的ZmCIPK42主要以包涵体形式存在,用Ni-NTA树脂可以纯化获得有活性的ZmCIPK42蛋白.[结论]28℃诱导后ZmCIPK42可以有活性的蛋白.用His作为标签纯化ZmCIPK42蛋白,可高效获得大量纯化蛋白.     

传染性造血组织坏死病毒糖蛋白基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法扩增了传染性造血组织坏死病毒IHNV-ZYX株编码的糖蛋白(G)基因,将G基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta( DE3)中得到了表达.SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小的G蛋白.提取G蛋白的包涵体,并制备抗血清.间接ELISA和Western-blott...     

苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的克隆及原核表达

【目的】获得苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的全长序列,并在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达,为探明苹果蠹蛾雌雄间的信息素交流机制奠定基础。【方法】提取苹果蠹蛾触角总RNA,利用RT-PCR、3′-RACE和5′-TAIL-PCR扩增技术获得CpomPBP2基因的全长序列;通过构建原核表达载体pET28a-CpomPBP2对CpomPBP2进行重组表达与检测;并对融合蛋白pET28a-CpomPBP2进行Western blot鉴定及可溶性鉴定。【结果】以苹果蠹蛾触角总RNA为模板合成cDNA第一链,以cDNA为模板经RT-PCR、3′-RACE和5′ TAI PCR扩增,得到CpomPBP2基因约3 000 bp的全长序列;测序结果表明,CpomPBP2基因开放阅读框长约510 bp,编码169个氨基酸,预测的成熟蛋白分子质量为16.45 ku,等电点(pI)为5.09。经SDS-PAGE电泳分析表明,融合蛋白CpomPBP2以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为20 ku。Western blot鉴定结果显示,获得了目标蛋白CpomPBP2。用终浓度1.0 mmol/L IPTG诱导8 h后,可获得大量融合蛋白。【结论】获得CpomPBP2的全长序列,成功构建了CpomPBP2的原核表达载体,经Western blot鉴定,CpomPBP2表达正确。     

线虫fat-1基因的原核表达及其抗体的制备

通过RT-RCR得到线虫f a t-1基因全长,将其N端亲水区克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-f a t1-N,将其转化大肠杆菌,并进行诱导表达。对表达产物G ST-f a t1-N融合蛋白进行纯化,制备其抗体,并对抗体效价进行了检测。结果表明,线虫f a t-1基因能在大肠杆菌中表达,制备的抗体能识别在原核表达系统内表达的G ST-f a t1-N融合蛋白,且效价很高,达到1∶107。     

球孢白僵菌CDEP2基因原核表达、蛋白纯化及多克隆抗血清制备

类枯草杆菌蛋白酶是昆虫致病真菌重要的毒力因子,利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因.将其与质粒pET28a连接,构建重组原核表达载体pET28-CDEP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测His-CDEP2融合蛋白以包涵体方式大量表达并对其进行纯化.用SDS-PAGE分离纯化的CDEP2蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗血清.Western blotting免疫印迹检测分析表明,该抗血清对CDEP2蛋白有特异性识别能力,可用于对CDEP2蛋白功能的进一步研究.     

小麦热激蛋白60(HSP60)基因的克隆与原核表达

[目的]构建小麦热激蛋白60基因的原核表达载体,并在E.coli中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的小麦热激蛋白60基因序列设计合成1对引物P1/P2,利用RT-PCR方法从小麦RNA中扩增小麦HSP60基因,应用基因重组技术构建pGEX-4T-1-HSP60表达载体,将构建好的小麦HSP60基因原核表达载体pGEX-4T-1-HSP60转化至大肠杆菌表达菌株E.coli-BL21感受态细胞。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定鉴定正确后,与GenBank中收录的小麦HSP60基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下获得了目的蛋白,所表达的GST-HSP60融合蛋白分子量约为90 KD。蛋白质电泳（SDS-PAGE）结果表明,表达的蛋白条带与预期的大小一致。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-HSP60的原核表达载体,在E.coli-BL21中高效表达了HSP60蛋白,为进一步研究该蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。     

小鼠Ii基因克隆、表达及其抗体制备

为了获取小鼠Ii编码基因,利用原核表达系统进行诱导表达,提取纯化目的蛋白并制备其相应抗体,应用RT-PCR获取小鼠Ii编码基因;插入pGEX-4T-1表达载体,SDS-PAGE分析蛋白表达;纯化融合蛋白,免疫家兔,制备抗血清.结果扩增出了与预期大小相同的700 bp的特异性基因条带,其与GenBank登录的鼠Ii基因同源性高达99.2%～99.8%;SDS-PAGE检测到大小约49.5 ku的特异性蛋白条带;应用琼脂双向免疫扩散、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光法等进行抗体活性鉴定,证明获得了特异性强、具有良好生物活性的抗体.成功克隆了小鼠Ii编码基因,有效进行了诱导表达,并制备了具有良好免疫学活性的特异性抗Ii抗体.     

鲤鱼重组IL–17N的原核表达条件优化及蛋白纯化

为获得可溶的鲤鱼IL–17N重组蛋白,构建原核重组表达质粒GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N,确定IL–17N的最适促溶标签,并优化其诱导表达条件(诱导剂异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导时间和诱导温度)。结果:成功构建了鲤鱼IL–17N原核重组表达载体GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N;融合标签MBP、SUMO–GST和GST的促溶效果依次降低,SUMO–GST–17N、MBP–17N上清蛋白占总蛋白比例分别为47.4%、87.0%;MBP–17N的最佳表达条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃诱导8～12 h;经过镍柱纯化,获得可溶MBP–17N蛋白,每克总菌约获得0.09 mg MBP–17N蛋白。     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。