鸡肾型传染性支气管炎的防治

肾型传染性支气管炎是由病毒引起的急性、高度接触传染性的呼吸道疾病,是鸡传染性支气管炎的一种病理表现形式.我国于1972年由邝荣禄首次报道在广东省有传染性支气管炎存在,随后绝大多数省份都有该病发生的报道,在此期间发生的传染性支气管炎也主要为呼吸型.1962年,Winterfied等在美国发现了致肾病变型传染性支气管炎病毒,并将其命名为Holte株、Gray株、CV56b株、Wolgemuth株等,其中Gray株是缓和型毒株.同年,Cumming在澳大利亚分离出N1/62(T株),该病毒被认为是嗜肾型传染性支气管炎病毒的代表株.20世纪90年代以来,肾型传染性支气管炎在国内也相继爆发,流行十分广泛.尤其是最近几年,肾型传染性支气管炎在我国肉鸡群中大面积流行,给养鸡生产带来了严重的损失.     

鸡传染性支气管炎病毒河南流行毒株S1基因的变异分析

经鸡胚接种、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、气管环培养等方法从河南不同地区发病鸡群中先后共分离、鉴定出7株鸡传染性支气管炎病毒(IBV).应用RT-PCR方法对7株病毒以及IBV H120疫苗株的S1基因全序列进行扩增,并对其进行克隆测序及序列分析.结果显示:8株IBV的S1基因全长分为4类,分别是1632、1620、1617和1611 bp;序列相互之间存在多位点变异,同时存在型特异性的插入和缺失;其S蛋白裂解位点序列模式有HRRRR、RRFRR和RRSRR 3种;同源性及遗传进化分析显示Jin-13为呼吸型毒株,YI为ArkDPI型肾型毒株,HN/SG株与国内其他肾型分离株亲缘关系均较远;河南肾型分离株HN/HL、XP/1/09、XP/3、WZL与山东肾型分离株之间的同源性较高且其亲缘关系最近,而与河南HN99株的亲缘关系较远.说明河南地区存在不同的IBV流行毒株,这些漉行毒株在主要保护性抗原蛋白S1基因上发生了一定的变异.     

腺胃型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从河北病鸡肿大腺胃中分离到1株病毒(命名为CK/CH/HBHS/07F株),经鸡胚传代、血凝特性测定、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)干扰试验、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)膜蛋白(membrane protein,M)基因序列分析、人工感染试验等方法对该病毒进行了鉴定。该分离毒株感染鸡胚的尿囊液没有直接血凝活性,经胰酶处理后可凝集鸡红细胞,其血凝活性可被IBV阳性血清所抑制;经鸡胚传至第3代时,可致死鸡胚或出现侏儒胚;序列分析结果表明,该病毒M基因与18株不同致病型IBV毒株间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82.8%~94.1%、82.4%~97.4%,与腺胃型毒株CK/CH/LJL/04I同源性最高,该分离株能人工复制出与自然病例相似的病理变化。初步证实CK/CH/HBHS/07F株为腺胃型IBV。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病株的分离与鉴定

[目的]分离一株近期流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒并解析其基因变异情况.[方法]适当处理猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性临床样品,接种非洲绿猴胚胎肾细胞进行病毒分离,间接免疫荧光试验对所分离病毒进行鉴定;同时用RT-PCR技术扩增其全基因组,并进行序列测定与分析.[结果]分离培养物可引起非洲绿猴胚胎肾细胞出现稳定的细胞病变,间接免疫荧光试验显示有许多特异性荧光,分离培养物中存在猪繁殖与呼吸综合征病毒.病毒全基因组大小15 323个核苷酸,在非结构蛋白2基因有30个氨基酸缺失的典型标记;其与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株JXA1株、HUN4株和SD-CXA/2008株之间的核苷酸同源性较高,达到98.9％以上;该毒株与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒SD-CXA/2008株在同一分支上.[结论]分离出一株典型的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株.     

不同禽类传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆与序列比较分析

应用RT-PCR法对分离于不同禽类的IBDV HN 01株(鸡源)、W J株(乌鸡源)和YL 997株(鸭源)的VP2基因分别进行了克隆,对其与核苷酸序列及其编码的VP2蛋白氨基酸序列进行了分析,并对此3株IBDV与标准血清Ⅰ型STC株的VP2基因和VP2蛋白进行了同源性分析。结果表明,W J株、LY 997株、HN 01株与标准血清Ⅰ型STC株的核苷酸同源性分别为91.30%,92.50%和93.47%,氨基酸同源性分别为92.74%,91.90%和95.10%;HN 01株与W J株的核苷核和氨基酸的同源性分别为97.9%和98.4%,HN 01株与LY 997株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为98.7%和99.05%,W J株与LY 997株的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%和97.68%,3个毒株的VP2基因序列均完全具备超强毒株的主要特征,均为超强毒株,且与标准血清Ⅰ型STC株的核苷酸和氨基酸同源性均较低;3个野毒株之间虽具有较高的同源性,但相互之间也有一定的差异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的遗传变异分析

用间接免疫荧光试验和RT-PCR方法,从河南省不同地区送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料中分离到16株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),扩增分离株的ORF5基因并进行序列测定、比较分析和绘制进化树.结果表明,16株分离株之间的氨基酸序列同源性为88.1%～99.8%;与欧洲型LV株和美洲型VR-2332株的氨基酸序列同源性分别为54.0%～54.5%和88.1%～99.2%,证明分离的16株病毒均为美洲型.用DNAstar等软件对16株分离株推导的氨基酸序列作进一步比较分析,发现16株分离株ORF5基因编码的gp5蛋白的抗原区、潜在疏水区、跨膜区和N-糖基化位点分布均有差异,与其它美洲型毒株也存在一定程度的差异,说明在河南流行的PRRSV存在明显的遗传差异性.     

2株猪圆环病毒2型分离毒株全基因组的克隆及序列分析

参考GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列,设计2对引物,通过PCR技术扩增出2株PCV2流行株的全基因,并进行了序列测定分析.结果表明,2个分离株基因组全长分别为1 767 bp和1 768 bp,2个分离株之间的核苷酸相似性为97.3%,与GenBank上已发表的PCV2分离株之间的相似性为93.8%～99.3%.2个分离株的ORF2核苷酸序列相似性分别为91.3%～99.6%和90.6%～98.0%,存在一定的变异.     

PRRSV辽宁分离株ORF3基因的克隆与序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的ORF3基因全长cDNA,结果该分离株ORF3基因cDNA编码区长765bp,可编码254个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%,因此推测辽宁分离株属于美洲型。     

新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及Nsp2和ORF5基因遗传变异分析

为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异特征,利用RT-PCR、ORF5和部分NSP2基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒.分离的病毒株被鉴定为PRRSV美洲型,命名为XJ-Q株.该株病毒与香港分离株HK13亲缘关系最近,与国内变异株(HUB1和JXA1)同源性较为亲近.与美洲型标准毒株VR-2332相比,该分离株在481位和532～560位共有30个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV变异株相比,在487～489位有3个氨基酸的独特缺失.结果表明,新疆分离株为PRRSV美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株.     

鸡传染性腺胃炎的诊断和预防

鸡传染性腺胃炎是近几年出现的一种新病,主要发生在20—80日龄,临床表现为有呼吸道症状,生长停滞,消瘦死亡,剖检以腺胃肿大为特症。研究表明该病的病原为冠状病毒,其形态和理化特性与鸡传染性支气管炎病毒相似,但血清型学特性与呼吸道型和肾型传支有较大的区别,因其最大的病变是腺胃肿大,故暂定名为腺胃型传染性支气管炎或传染性腺胃炎。     

鸡传染性支气管炎病毒血凝性的研究

用中国和澳大利亚分离的Ａ型魏氏梭菌培养液、Ⅰ型卵磷酯酶Ｃ和胰酶处理鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ），制备的血凝抗原能凝集鸡红细胞，为鸡传染性支气管炎的诊断提供了方法。对鸡传染性支气管炎Ｍ（４１）、Ｈ（１２０）、Ｈ（５２）、Ｇｒａｙ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｔ、ＧＩＢＶ等７个毒株进行了血凝性的比较，以Ｈ（１２０）毒株血凝价最高，其次是Ｍ（４１）、ＧＩＢＶ、Ｇｒａｙ，而Ｈ（５２）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｔ等毒株血凝性低或无血凝性。作者还对影响鸡传染性支气管炎病毒血凝试验的各种因素进行了研究。     

Asia1型口蹄疫病毒基因组的测序分析

对中国口蹄疫病毒Asia1/JS/2005毒株的全基因组进行了分段扩增并测序。结果表明,该毒株的基因组全长为8 174 nt,其中 5’UTR 为1 092 nt;ORF为6 990 nt;3’UTR为92 nt。利用DNAstar软件对该毒株和Asia1型其他24毒株基因组序列进行同源性分析表明,该毒株的非结构蛋白和5’UTR比较保守。研究还发现了可能与生物学功能相关的新的保守和变异区域。系统树分析表明Asia1/JS/2005, Asia1/1/YZ/2006,Asia1/WHN/2006,Asia1/HN/2006和Asia1/YS/2005属于同一分支,表明这些毒株间有着紧密的遗传关系,其中与其亲缘关系最为密切的是Asia1/YS/2005。     

30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析

利用IBVS1基因特异性引物对30株IBV毒株进行RT-PCR扩增,产物经纯化后进行测序,并利用DNAstar MegAlign软件分析S1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。结果表明,广西分离株GXIB/02与Mass41、Conn、Ark、PA、Del、JMK、H52参考株的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均较低,与美国80年代分离的毒株MW34、hotle、cal15、AustT株的序列同源性也很低。这一结果与血清学试验结果相吻合,说明广西分离株GXIB/02与当今流行的标准株以及过去流行的毒株都不相同,是一个新的变异株,由此推断广西已有不同血清型IBV毒株存在,可能导致新的变异株流行。     

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株LH2/01/10纤突蛋白基因的遗传变异

 对传染性支气管炎病毒LH2/01/10的S1和S2基因分别进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定。结果表明,其S基因由3 495个核苷酸组成,编码的多肽由1 164个氨基酸残基组成。S蛋白的切割识别位点氨基酸组成为组氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸(HRRRR)。推测其裂解后形成的S1和S2亚单位中,S1由539个氨基酸残基组成,S2由625个氨基酸残基组成。序列分析发现:LH2/01/10与Beau、M41、CU-T2、D1466、DE072、Holte、Gray、Ark99、Conn、H52、KB85     

2010—2013年我国鸡传染性支气管炎病毒分离株S1基因分子特性分析

为掌握近年来我国传染性支气管炎病毒的流行动态和变化规律,利用检测转化至克隆载体鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,应用MEGA5分析软件进行聚类分析,并对瑞普生物疫病诊断研究服务中心2010—2013年间从我国野外分离并测定的30株传染性支气管炎的S1基因序列与常用疫苗毒株和GenBank中代表性IBV毒株的对应基因序列进行比较,结果发现:1)30株野外分离株可分为2个基因型:LX4型和TW型,分别占总数的93.3%和6.7%;2)LX4型分离株S1基因和氨基酸序列与常见疫苗毒株序列差别很大,同源性仅分别为77.6%~86.3%和75.8%~85.7%;3)分析S基因裂解位点时发现同一基因型毒株的裂解位点氨基酸序列高度趋同,且型间差异性较大。可见,近年来我国主要IBV分离株属于LX4型,并且彼此间亲缘关系较近,与我国现用传染性支气管炎主要弱毒疫苗和国外参考株属于不同的基因型,这可能是导致疫苗免疫失败,传染性支气管炎(IB)在鸡群中爆发的主要原因。该研究结果为筛选针对我国目前流行IBV毒株的疫苗株提供参考。     

检测感染鸡体内传染性支气管炎病毒反转录套式PCR方法的建立

根据先前克隆并测定的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列，设计了2对引物，通过对IDV各毒株(M41，H52，H120，Aust-T以及野毒株等)攻毒鸡的组织中的IBV进行反转录套式PCR检测，结果均为阳性，而对鸡的其他传染病病毒(IBDV，AIV，NDV)进行检测，结果均为阴性。结果表明所建立的反转录套式PCR方法可用于感染鸡体内IBV各血清型毒株的检测。     

鸡传染性支气管炎病毒在鸡胚肾细胞和气管环培养中的适应性比较

将６株鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分别接种鸡胚肾细胞（ＣＥＫＣ）和气管环培养（ＴＯＣ）。６株病毒无论是否已经适应于鸡胚，都在气管环培养中能引起病变。病毒适应于ＣＥＫＣ，是与病毒在鸡胚和细胞培养上的传代次数有关。分别用ＳＰＦ鸡胚、非免疫鸡胚和普通鸡胚制备的ＴＯＣ测定ＩＢＶ－Ｍ４１株的ＩＤ５０，结果用ＳＰＦ鸡胚和非免疫鸡胚制备的ＴＯＣ测定的ＩＤ５０都获得较高滴度，而在普通鸡胚制备的ＴＯＣ中ＩＤ５０明显低。     

RT-PCR和Digoxigenin标记的核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒试验研究

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一ＩＢＶＨ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ，分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０ｂｐ，２２８ｂｐ，６０２ｂｐ，的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０，Ｈ５２，Ｍ４１，Ｃｏｎｎ，Ｇｒａｙ，Ｔ，Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒，上毒，云毒，ＨＫ，１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ。结果除Ｈｏｌｔｅ株，２个分离株（宜毒，云毒）外，其余均被成功地扩增出６０２ｂｐ的片段。将ＩＢＶＨ１２０株０６ｋｂＰＣＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记为探针，分别与上述各ＩＢＶ毒株的核酸及其扩增产物进行核酸杂交，均呈现阳性反应，而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＤＮＡ，ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液抽提物反应。ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交技术提供了直接从尿囊液中快速检测出病毒，作为诊断ＩＢＶ的新方法。     

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

1材料与方法 1．1病毒来源鹅副粘病毒分离株GX1株由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存。 1．2试剂及仪器各种PCR反应试剂、PMD-18T载体、胶回收试剂盒、限制性内切酶等均购自宝生物工程（大连）公司。仪器：恒温孵化箱、PCR反应仪、超速离心机、移液器等。