二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。     

基于琼脂糖凝胶电泳的小麦SSR扩增体系优化

以小麦基因组DNA为试验材料,探索SSR扩增反应中5种反应组分(模板DNA、dNTPs、引物、Mg~(2+)和Taq DNA聚合酶)对SSR扩增结果的影响.研究发现,引物、Mg~(2+)和Taq DNA聚合酶对PCR扩增结果的影响最显著,其次是模板DNA,dNTP对PCR扩增结果的影响不明显.此外,借助该优化的SSR反应体系,对小麦7B染色体上的多对SSR引物进行了多态性筛选.试验结果表明,优化的SSR扩增体系结合高浓度琼脂糖凝胶能够对显性或差异显著的共显性标记进行高效分离.     

稻瘟病菌SSR反应体系的优化

稻瘟病菌SSR检测是分子标记辅助育种的一项重要技术。为优化SSR反应体系,以稻瘟病菌菌株504为供试材料,采用单因素筛选法及L9(34)正交试验设计,研究了稻瘟病菌SSR分析中PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响。结果表明：在总体积为20μL的PCR反应中,Taq DNA聚合酶的最适用量为1.0U;Mg2+、dNTP和引物的最适终浓度分别为1.0mmol/L、100μmol/L和0.4μmol/L。利用该体系进行扩增,所得谱带清晰、稳定、非特异性带少。     

药用菊花SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为进一步开发利用药用菊花种质资源和开展分子标记辅助选择育种,本研究利用L25(56)正交设计对影响药用菊花SSR-PCR反应的模板DNA、Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物等5个因素进行优化,并对SSR引物进行筛选。结果建立了药用菊花SSR-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 60 ng,正、反向引物0.25μmol/L,d NTPs 0.3 mmol/L,Mg2+3.0 mmol/L,Taq酶1.5 U。运用优化后的反应体系,从136对引物中成功筛选出了扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物57对,大多数条带大小集中在100~500 bp,不同引物扩增的条带数为5~15条。优化的SSR-PCR反应体系在多个药用菊花品种遗传多样性研究中得到了验证,获得了稳定性、重复性良好和多态性丰富的扩增图谱。该体系的建立可为今后利用SSR标记对药用菊花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。     

正交设计优化大豆SSR-PCR反应体系及引物筛选

以大豆(Glycine max L.)为材料,研究了PCR反应体系的主要成分对大豆SSR扩增结果的影响,并确定影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量.以CTAB法提取的大豆叶片DNA为模板,应用L16(44)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系.结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响.大豆SSR-PCR优化反应体系为:2.0 μL 10×PCR Buffer,30 ng模板DNA,150μmol/L dNTP,0.4 μmol/LSSR引物,1.5 U Taq DNA聚合酶,2.0 mmoL/L Mg2+,加ddH2O至终体积20.0μL.优化的PCR扩增程序为:94℃预变性5 min.94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸5 min,4℃保存.同时选用200对大豆引物对2份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物74对,用于大豆SSR标记的进一步研究.     

鸭茅SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

应用L16(44)正交设计对影响鸭茅SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于鸭茅的SSR反应体系和扩增程序.在15μL体系中各反应的最适合含量为:50ng模板DNA,240μmol/L dNTP,0.4μmol/L SSR引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,1.5μL 10×PCR Buffer,2.5mmol/L MgC12.PCR适宜扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性30 s,52℃复性30 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.并对引物最适合退火温度进行优化,最终确定引物退火温度为48～52℃.同时选用100对鸭茅引物对4份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物30对.用于鸭茅SSR标记的进一步研究.     

均匀设计优化棉花ISSR-PCR反应体系

为探索适宜棉花的ISSR-PCR反应体系,采用两轮均匀设计试验,对ISSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs、模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶的浓度或用量进行优化。结果表明,棉花20μL的ISSR反应体系的最佳组分包括2μL 10×PCR Buffer、0.5 U Taq DNA聚合酶、40 ng模板DNA、0.25 mmol.L-1 dNTPs、0.5μmol.L-1引物和2.0 mmol.L-1 Mg2+。利用8个棉花品种和三条不同引物验证该反应体系,结果表明,该反应体系的稳定性和重复性较好。     

棉花枯萎病菌AFLP分子标记体系的建立及初步应用

建立并优化了基于HaeⅢ/PstⅠ酶切的棉花枯萎病菌AFLP分析的最佳反应体系,并从32对引物组合中筛选出适合该反应体系的引物组合3对.应用该技术对存在于我国的棉花枯萎病菌3号、7号和8号生理小种的标准菌株进行分析,结果表明该技术能够有效地将这3个标准菌株区分开;通过该体系对来自我国4个省的20个棉花枯萎病菌菌株进行分...     

桃SRAP体系的优化及与SSR在桃品种鉴定上的比较

为确立的桃10 μL SRAP反应体系,以桃部分品种为试材,采用均匀设计,对SRAP-PCR反应体系中Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物5个组分的浓度进行优化.结果表明,桃10 μL的SRAP反应体系的最佳组分包括2 U Taq DNA聚合酶、50 ng模板DNA、0.6 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物、2.0 μL 10×PCR Buffer+Mg2+.利用所确立的体系对其他部分桃种质进行扩增的结果清晰可靠,多态性好.并且利用随机挑选的SRAP引物和SSR引物分别区分鉴定8种桃种质,发现SRAP用5对可以将桃种质区分开,而SSR用13对才区分开,说明在桃品种鉴定上SRAP比SSR更省时方便,而且操作相对简单,适用性强.     

构建黍授分子遗传图谱ssR引物的筛选

采用SSR-PCR扩增技术,将实验室利用高通量测序与磁珠富集法结合开发得到的1210对黍援SSR引物进行筛选,筛选出在会宁大黄糜、陇糜8号、太原55号和会宁野糜子4个泰援品种之间表现出条带清晰、多态性明显、重复性较好的引物;并通过提取DNA以及PCR过程中退火温度的简单优化来建立比较适宜的泰援SSR分子标记反应体系。结果表明,在DNA提取过程中将ddH20的量减少到100μL,增加65℃的水浴时间并增加4%β-筑基乙醇和DNA浓度等可以获得较高质量的DNA。利用优化好的反应体系从1210对SSR引物中筛选出116对多态性较好的引物,占总数的9.59%,其中,群体一的2个亲本所特有的引物有36对,群体二的2个亲本中特有的引物有97对,2个群体共有的多态性引物有19对;对引物碱基结构分析发现,选用的1210对引物中有1173个双碱基重复SSR和36个三碱基重复SSR;筛选到的多态性引物中双碱基重复SSR有102个。三碱基重复SSR有14个。筛选出的多态性SSR标记能用于泰援的遗传多样性和群体遗传结构研究。     

新疆棉花黄萎菌不同致病类型的RAPD指纹分析

用 RAPD- PCR技术 ,对采自新疆各地的 2 7个棉花黄萎菌株的遗传分化及致病性进行了研究。从 1 2 0个随机引物中筛选出 1 1个随机引物 ,共在 2 0 4个位点上扩增出 RAPD谱带 ,其中 1 88个为多态性位点 ,占 92 .1 6%。RAPD电泳条带差异表明 ,新疆棉花黄萎病菌种群内部存在着显著的遗传分化。对 RAPD谱带进行聚类分析 ,将 2 7个菌株划分成 3大类群 ,这 3大类群与根据鉴别寄主反应划分的不同致病类型有一定的相关性 ,RAPD谱带差异与菌株的地理分布也有一定的联系     

我国棉花黄萎病菌的群体遗传

从 1 2 6条随机引物中筛选出 9条能产生多态性好、条带稳定的引物。用这 9条引物对来自我国主产棉区河北、河南、江苏、山东 4个群体的 9个亚群体 1 1 7个菌株进行 RAPD扩增。对各个群体、亚群体的群体遗传结构分析表明 ,各省群体遗传相似性较高 ,总的遗传变异量为 0 .0 947,其中72 .5%由群体内的变异引起 ,1 2 .5%由省内群体间引起 ,1 5%由群体间的变异引起 ;群体间的基因流动值为 2 .83 ,群体间、亚群体间均存在较高的基因流动 ;落叶型特征条带在各个亚群体内出现频率均很高 ,表明棉花黄萎病菌落叶型菌株在我国主产棉区的河北、河南、山东、江苏 4省棉区分布广泛 ,并已成为或正在成为优势种群     

河南省不同地区棉花黄萎病菌分离物致病性及其毒素致萎活性测定

在河南省不同地区分离并鉴定33株棉花黄萎病菌分离物,并进行了致病力和粗毒素致萎活性测定。致病力结果表明,河南省棉花黄萎病菌分离物可分为强、中、弱3种致病力类型,分别占48.5%、21.2%、30.3%。河南省同一地区内不同分离物间致病力差异明显。粗毒素致萎活性测定结果表明,黄萎病菌强致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较强,弱致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较弱,强、中、弱3种致病力类型分离物在72h时对棉苗的平均致萎指数分别为63.82、52.38、45.83。采用考马斯亮蓝法测定不同分离物粗蛋白含量,结果表明,不同黄萎病菌分离物分泌的粗蛋白含量存在明显差异,且与其所致的病情指数呈显著正相关。     

The Monitoring of Cultural Characteristics,Pathotype, Pathogenicity Differentiation and ISSR Genetic Variation of Verticillium Dahliae Isolates from Cotton in Northern Xinjiang

[Objective] This research focused on determining the strains variation and pathogenic differentiation of Verticillium dahliae from cotton in north of Xinjiang. [Method] Seventeen Verticillium dahliae single spore strains were recovered from cotton in northern Xinjiang. Cultural characteristics, pathotype, pathogenicity and ISSR genetic variation of these strains were studied. [Result] The results indicated that all the examined strains were sclerotia type and the defoliating and non-defoliating strains accounted for 76.5% and 23.5%, respectively. The average disease index of defoliating strains (58.72) was slightly higher than non-defoliating strains (52.7). Comparing with nondefoliating strains, defoliating strains had higher disease index on Simian 3 cultivar and lower disease index on Ao 3503. Based on average disease index, the tested isolates could be divided into strong pathogenic type, middle pathogenic type and weak pathogenic type. No strains were weak pathogenicity, while the strong pathogenic strains and middle strains occupied for 94.12% and 5.88%, respectively. The genetic variation of these isolates was wide from ISSR fingerprint analysis and had certain correlation to pathotype. Most of the defoliating strains and non-defoliating strains were in different clades, respectively. The results also showed three defoliating strains xj13-3①, xj13-3② and xj13-3③ isolated from the same field were in different sub-clades. [Conclusion] These results indicate complicated genetic variation ofVerticillium dahliae in northern Xinjiang.     

利用染色体片段代换系定位棉花抗黄萎病QTL

通过陆地棉与海岛棉杂交并与陆地棉回交,获得1个染色体片段代换系苏VR043,抗江苏非落叶型黄萎病菌系BP2。分子检测表明,苏VR043兼有陆地棉苏棉8号的遗传背景和海7124的D4染色体片段。以苏VR043和苏棉8号为亲本构建包含176个单株的F2群体,通过标记分析和F2:3家系抗病鉴定,发现抗病性状与标记NAU3392连锁,p值为2.3×10-12。根据棉花D组染色体测序结果,参照置换区段的基因组序列,合成92对SSR引物;PCR扩增分析发现,有5对引物在苏棉8号和苏VR043之间表现多态性,并将抗病主效QTL定位在标记ZHX32和NAU3392之间,标记间遗传距离为3.2 c M,QTL解释表型变异64.8%。同时参照棉花D组测序结果,提取对应的置换区段序列,预测包含63个基因,基因聚类分析表明7个基因参与抗逆反应,其中1个基因与抗病相关。     

陕西关中地区棉花黄萎菌营养亲和性研究

 由于陕西关中地区的泾阳菌系被定为致病性最强的生理Ⅰ型,本试验采用营养亲和性的方法对陕西关中地区采集的18个菌株以及陕西省植保所提供的新疆和田菌系、陕西泾阳菌系和河南安阳菌系进行了研究。经不同氮源利用的鉴定,结果为：21个菌株共获得364个nit突变株,其中nit1 289个,占总量的79.40%;nitM 72个,占总量的19.78%; nit3仅有3个。经营养体亲和性配对测试,21个菌株可分为3个营养亲合群(VCGs)。 新疆和田菌系属于亲合群2(VCG₂),河南安阳菌系属于亲合群3（VCG₃）。其余的18个菌株属于亲和群1(VCG₁)。B18没有产生突变体。且发现不同菌株营养体亲和产生的亲和带形态有差异,且具一定稳定性。由此可见, 造成陕西关中地区棉花黄萎病发生严重并造成经济损失的主要原因是由于主要致病菌属于VCG₁。     

黄萎病菌侵染对感病棉花品种叶片蛋白质组的影响

为进一步探索黄萎病菌与棉花的相互作用,以感黄萎病棉花品种冀棉11为实验材料,在接种大丽轮枝菌V991 3 d后提取叶片蛋白,运用双向电泳和质谱分析技术研究黄萎病菌侵染后叶片蛋白质组学的变化。分析发现,与对照相比差异表达量在2倍以上的蛋白点有22个,其中上调表达的蛋白点10个,下调表达的蛋白点12个。质谱鉴定发现,上调表达的蛋白包括ATP合成酶β亚基,Ru Bis CO活化酶1,Ru Bis CO活化酶α2以及果糖-1,6-二磷酸醛缩酶,下调表达的蛋白包括质体叶绿素AB结合蛋白,核酮糖二磷酸羧化酶大链以及核酮糖二磷酸羧化酶小链。分别对下调表达的蛋白rubisco小亚基基因(RBCS)和叶绿素AB结合蛋白基因(cab)、上调表达的蛋白Ru Bis CO活化酶1基因(RCA1)进行荧光定量PCR,发现接种黄萎病菌后3个基因在m RNA水平与蛋白水平上的变化是一致的。通过分析推测,黄萎病菌通过与参与光合能量代谢的蛋白相互作用,破坏植物的光合作用,近而引起棉花叶片的萎蔫与凋零。     

新疆乌苏地区棉花黄萎病菌分离鉴定和致病力分析

为了研究新疆乌苏地区棉花黄萎病菌的致病型和群体间的变异性,从该地区不同棉株上分离8株病原菌,通过对病原菌的菌落培养形态、菌丝和孢子的显微结构、对寄主的致病性、ITS序列的克隆、菌株间的系统进化及营养亲和性分析等方面进行了研究。结果表明：分离的病原菌均属于非落叶型棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae),为大丽轮枝菌;系统进化树显示8株菌在系统进化上属于2个不同的进化方式;8株黄萎病菌在相同的寄主上致病性存在差,Vd-1菌株致病力最强,Vd-34致病力最弱;不同致病力的菌株之间的营养亲和性分为2个营养亲和群(VCGs)。新疆乌苏地区棉花黄萎病的致病菌是大丽轮枝菌,病原菌在进化上差异显著。     

木霉菌对棉花黄萎病菌拮抗的作用

以绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)，以及二株未知种名的木霉菌株(Trichoderma spp.)为供试菌，采用对峙培养测定其对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)的抑制作用，并研究了四种木霉菌产生的非挥发性代谢物对菌丝干重的影响。结果表明：在对峙培养中，木霉菌对棉花黄萎病菌均有明显抑制作用，木霉菌产生的非挥发性代谢物可以强烈抑制棉花黄萎病菌生长，明显降低其菌丝干重，并具有热稳定性。光学显微镜下观察，木霉菌丝在棉花黄萎病菌丝上平行或波浪式生长且棉花黄萎病菌丝出现细胞原生质浓缩和菌丝断裂等现象。     

棉花黄萎病菌致病类型研究

以研究手段为主线，从形态学特征、凝胶电泳、血清学反应、营养体亲和性及几项分子生物学技术等方面讨论了目前国内外在划分棉花黄萎病菌种内致病类型上的研究进展状况，并在本文基础上作了总结。