花粉特异性核糖核酸酶基因诱导籼稻雄性不育及其遗传研究

以水稻愈伤组织和悬浮细胞系作为基因枪转化的外植体,把水稻花粉特异性基因PS1启动子与barnase构成的嵌合基因导入籼稻,获得籼稻五个品种Basmati 1、青油占、胜优2号,明恢63,新山占29的转基因植株.试验以两个质粒PS1- barnase和pILTAB227共转化的方法,以潮霉素B作为筛选因子,选择抗性愈伤及再生植株.获得的barnase转基因植株的育性比未转化的对照明显降低,表现为部分不育和完全不育.除barnase阳性转化株平均株高比对照有所降低外,营养器官发育正常,雌性可育.完全不育的植株花粉粒畸形,不能被I-KI溶液染色,但它们与正常植株杂交能够获得杂交种子.转基因植株的Sonthern杂交分析表明,bamase基因普遍为多拷贝整合.对转基因植株白交及与非转化株测交后代以点杂交分析bamase转基因的遗传行为,发现转基因的遗传符合1～3个插入位点的孟德尔遗传模式.     

利用共转化方法创制携带Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记转基因水稻

水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。     

获得抗稻瘟病和纹枯病的转多基因水稻

将多个抗真菌病基因连同筛选基因hpt一起导入一水稻品种中，共获得49个独立的整合有1～4个抗真菌病基因的转基因植株系。转基因植株中几丁质酶的酶活均高于非转化对照植株，且转多个几丁质酶基因或与β-1，3-葡聚糖酶基因一起的转基因植株较转单个几丁质酶基因的植株有更高的酶活性。抗病试验表明，这些不同组合的R2代转基因     

提高农杆菌介导法将PinII抗虫基因导入滇型水稻的转化效率

本论文对滇型水稻品种玉优一号、HT-7的愈伤组织诱导、基因转化及植株再生进行了研究。通过实验，将质粒pCAMBI1300上带有的PinⅡ抗虫基因导入水稻愈伤组织细胞中，获得了一批Hyg抗性植株。185株抗性苗经过PCR检测和叶片对潮霉素的抗性试验，证明其中有59株为转基因阳性植株。结果显示，受体、农杆菌状态以及共培养方式等是影响基因转化效率的关键因素；以叶片对潮霉素的抗性作为转基因植株的快速筛选是可行的，大大提高了检测效率。     

根癌农杆菌介导gna基因对水稻的转化

褐飞虱在中国分布很广,近年来已成为南方稻区的主要害虫。大量研究表明,进行抗虫基因分子育种是迅速改良水稻褐飞虱抗性的有效途径。采用农杆菌介导法将来源于大肠杆菌的6-磷酸甘露糖异构酶（PMI）安全选择标记基因和雪花莲凝集素（GNA）抗虫基因构建于同一表达载体上进行遗传转化,获得带有安全标记基因的抗褐飞虱转基因植株。通过PCR扩增、Southern印迹和GUS检测分析表明,PMI标记基因和抗虫GNA基因同时被转入部分植株中并得到了表达,其外缘基因主要以单拷贝的方式插入水稻基因组中。对随机选取的8个转基因单株T0代种子经含潮霉素的培养基培养15d后抗感苗数统计分析表明,绝大多数转基因植株后代符合单基因的遗传分离规律。     

CRISPR/Cas 9基因编辑技术降低贵州禾株高研究

为获得株高降低的贵州禾水稻新种质,以贵州禾高秆糯稻材料黎平杂边禾为研究材料,根据CRISPR/Cas 9靶位点设计原则设计水稻OsGA20ox2基因的特异性靶点sgRNA序列,构建水稻OsGA20ox2基因的CRISPR/Cas 9定点突变载体,利用农杆菌介导的愈伤转化法遗传转化黎平杂边禾,通过潮霉素筛选,以及PCR分子检测,获得16株转基因植株。对筛选获得的转基因植株基因进行测序,获得7株OsGA20ox2基因靶位点被编辑的突变转基因植株。研究表明,T_1代突变体植株株高比黎平杂边禾降低了29.6%。     

甘薯遗传转化研究现状、问题及展望

甘薯是世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物，由于遗传改良进展缓慢，转基因技术逐渐成为研究的热点，并应用于常规育种中去。到目前为止，甘薯已利用叶片、叶柄、茎、原生质体、愈伤组织、新鲜块根、胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系作为遗传转化受体材料，其中早期以叶片、叶柄为主，目前利用胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系作为转化受体的研究越来越多。用于甘薯遗传转化的方法有农杆菌介导法、电击法和基因枪法，其中以根癌农杆菌介导法为主。最初甘薯遗传转化外源基因表达频率很低，随着转化条件研究的深入，转化频率得到较大的提高，越来越多的目的基因被应用到甘薯遗传转化中去。到目前已有抗虫、抗病毒、抗病、抗除草剂和品质改良等五大类基因转入甘薯基因组中，并且获得了转基因植株。尽管甘薯遗传转化取得了一定的进展，但目前仍缺乏一个有效的遗传转化体系，获得的转基因植株数量有限，还不能应用于生产。存在转化基因型有限、外源基因匮乏、转化方法单一、标记基因存留的问题，以及还不清楚外源基因在转基因植株中的遗传规律等。因此，本文从甘薯遗传转化受体系统、主要转化方法、转化系统以及有益农艺性状基因的应用等对甘薯遗传转化现状进行了综述，分析了目前存在的问题，以及未来甘薯遗传转化研究方向和发展前景。     

水稻BZIP类转录因子在逆境胁迫下的作用

BZIP类转录因子在植物的逆境胁迫下起着重要作用。本研究构建水稻转录因子OsBZIP88过量表达载体pHB-Osbzip88和干涉载体RNAi-Osbzip88,通过遗传转化获得转基因植株,并对转基因植株在逆境胁迫下的表型鉴定。结果表明,过表达转基因植株抗胁迫能力高于野生型和干涉转基因植株。对OsBZIP88定量表达实验表明:OsBZIP88在水稻各组织中均有不同程度表达,且在叶片中表达量最高。本研究初步探明水稻转录因子OsBZIP88在水稻逆境胁迫应答中具有重要的作用,过量表达转录因子OsBZIP88能够增强水稻的抗逆能力。研究结果为进一步了解BZIP类家族基因和挖掘水稻抗逆基因提供了一定的依据。     

水稻常用的遗传转化技术及应用现状

1988年，三个独立的研究小组 率先报道获得了转基因水稻植株（Toriyama等,1988，Zhang,等,1988，Zhang等, 1988）。 十多年来，基因转移技术体系的建立一直是转基因水稻研究的重点。 在遗传转化技术应用方面，前期以采用原生质体为材料的PEG法和电激法为主，但原生质体 培养及再生对基因型依赖很大，转基因株育性较低；中期基因枪法得到了很大发展，迄今还 是单子叶植物首选的基因转化方法之一；而自90年代中期以来，农杆菌介导法在水稻基因转 移中日趋成熟，Hiei等（1994）创造的高效转化技术，首次证实了利用农杆菌转化水稻的 可行性，之后该法得到了广泛的应用。目前，水稻转化中应用比较普遍的方法有基因枪介导 法和农杆菌介导法。     

转基因小麦后代HMW-GS组成的变异研究

转基因技术应用于作物品种改良,要求外源基因稳定整合与表达,并且生物环境和自身遗传背景不被干扰[1].目前流行的植物转基因方法,需经历基因转移、组织培养再生植株和转基因植株的选择与繁殖等环节,每个环节都有可能产生不可预测的变异.有些变异与外源基因导入有关.Bregitzer等(1998)应用基因枪法获得转基因大麦,认为重要农艺性状抽穗期的延长是转化步骤引起了体细胞无性系变异[2].但有些变异与外源基因导入无关.Phan等(1996)把转基因水稻植株中基因组变异归因于组织培养[3].Barro等(2002)在田间评价转基因小麦的农艺性状时,没有发现因转化或组培引起表型变异[4].转基因植物在有性繁殖过程中,多拷贝外源基因也会对自身遗传背景产生影响[5].表型变异的原因可能是特定生化过程或蛋白质发生了质或量上的变化,但很少见遗传转化对植物内源非靶蛋白质影响的报道.     

杂交水稻主要亲本材料的垩白性状及其胚乳结构电镜扫描

【研究目的】针对杂交稻米品质问题，研究杂交稻亲本垩白形成与胚乳细胞形态结构和发育以及与淀粉粒之间的关系，为进一步研究杂交稻米高垩白形成机理奠定基础；【方法】对几个应用面积较大的杂交稻主要亲本和两个米质对照品种，按GB/T17891-1999方法调查其垩白性状，对其米粒胚乳结构和淀粉粒的采用扫描电镜观察分析；【结果】亲本材料间垩白性状差异首先表现在垩白率上，其次为垩白度，最后为垩白面积。高垩白的保持系和桂朝2号垩白主要发生在中、腹部，而相对低垩白的恢复系主要在中部，腹白少或无。垩白度与垩白率间存在明显的线性关系，与垩白面积无明显相关性。淀粉粒在米粒横断面上分布的均匀性与垩白率和垩白度有较大的相关性，分布越均匀则垩白率和垩白度越小；而长方柱状细胞层数和多少与垩白率和垩白度有一定的相关性但不明显。5个恢复系和3个保持系垩白米粒的背部淀粉粒普遍发育良好而中部较差；保持系与恢复系的差异主要表现在腹部淀粉粒的发育形态上。【结论】杂交稻保持系与恢复系的垩白发生部位有所差异，垩白形成与其淀粉粒的分布有重要关系；中、腹部淀粉粒发育异常容易产生垩白，主要受胚乳细胞生理发育规律的影响。     

穗肥施用时期对水稻籽粒中胚乳蛋白积累的影响

以武香粳9号为材料研究了不同穗肥施氮时期对水稻籽粒蛋白质积累的影响.结果表明:穗肥的施用提高了籽粒发育过程中单位干重蛋白质含量,以在倒0.5叶施用氮素穗肥影响最大;随施肥时期的延迟,稻米粗蛋白和谷蛋白含量逐步上升,醇溶蛋白含量逐渐降低;倒2.5叶施氮减少了强、弱势粒中蛋白组分的分布和含量,倒0.5叶施氮与此相反;胚乳     

水稻胚乳细胞增殖动态分析及其与籽粒生长的关系

以一中熟粳稻品种和两个中熟籼型三系杂交稻为材料,观察了不同粒位籽粒胚乳的细胞增殖动态和细胞充实过程,在以Ｒｉｃｈａｒｄｓ方程模拟的基础上进行生长分析,结果表明：胚乳的细胞增殖速率的变化呈单峰曲线,但相对增速率在增殖始期最高,强势粒起始分裂势高,花后２．８￣３．５天即达最高增殖速率,分裂强度大,活跃分裂期短,为２．８９￣３．６３天,分裂终止期在花后６￣８天,弱势粒胚乳细胞增殖起始期迟,分裂速率的变化     

转基因水稻中过量表达OsHPT提高胚乳中生育酚含量

为了提高稻米中生育酚的含量,本研究经农杆菌介导将由CaMV35S启动子驱动的水稻尿黑酸植基转移酶基因(OsHPT)导入粳稻品种武育粳3号,经RT-PCR等分析证明导入基因能在水稻胚乳中表达。HPLC测定结果表明,水稻中过表达OsHPT后,转基因稻米胚乳中总生育酚的含量极显著高于未转化对照,且主要表现为α-生育酚含量的提高,总生育酚和总维生素E含量最高可分别提高1.5和0.8倍。     

水稻淀粉合成代谢相关基因与千粒重QTLs的连锁分析

稻米淀粉的合成和积累是水稻千粒重形成的重要基础之一。在水稻千粒重QTLs定位分析基础上，对本研究克隆的14个水稻胚乳淀粉合成与积累相关基因及已报道的和预测的42个相关基因进行了电子定位分析，比较水稻淀粉合成代谢相关基因与千粒重QTLs的连锁关系。发现有38个基因位点与千粒重QTLs连锁，说明千粒重形成与胚乳淀粉积累与淀粉结构形成代谢密切相关。本研究结果将为进一步研究水稻产量形成的分子机理提供参考。     

水稻胚胎和胚乳双缺陷突变体eed1的表型与遗传分析

从由化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate,EMS)处理的粳稻品种中花11突变体库中,筛选到一个可稳定遗传的胚胎和胚乳发育缺陷的突变体,命名为embryo and endosperm defective 1 (eed1)。eed1籽粒千粒重、颖果的粒长、粒宽、粒厚、萌发率、总淀粉、直链淀粉和贮藏蛋白系列指标较野生型均显著降低。eed1颖果严重皱缩,且胚乳呈粉质。利用扫描电镜观察发现,与中花11相比, eed1胚乳中淀粉粒排列疏松,多以单一、分散的淀粉粒存在,且呈近似球形。eed1胚胎结构异常,部分颖果未见有胚胎分化的痕迹。qRT-PCR发现, eed1胚乳中参与淀粉和贮藏蛋白合成的大部分基因表达下调。利用eed1与籼稻南京6号杂交得到的F2分离群体进行基因定位分析,将EED1定位于9号染色体长臂672kb的范围内,包含114个开放读码框。本研究为进一步解析EED1基因调控水稻胚胎和胚乳发育的机制奠定了基础。     

水稻淀粉型胚乳细胞发育中核的衰退和水解酶的细胞化学定位

利用透射电子显微镜观察了水稻淀粉型胚乳细胞发育中核的衰退和水解酶的细胞化学定位。结果表明，随着淀粉型胚乳细胞的发育，细胞核表现出植物PCD的衰退特征：核变形，染色质凝缩，核周腔膨大。胞质中液泡和内质网包裹凝缩的染色质。淀粉型胚乳细胞发育的中、后期，水解酶（酸性磷酸酶、G-6-P酶、ATP酶、Ca²⁺-ATP酶）在核上表现较高的活性。上述结果表明，淀粉型胚乳发育经历PCD过程。     

结实期低温对杂交水稻胚乳结构的影响

以两系和三系杂交稻组合两优培九、103S/郑粳2号、丰优香占和汕优63为材料，分别于花后0~10 d、11~20 d和21~30 d 3个时期设18℃的低温处理，以常温（24～27℃）为对照，用扫描电镜观察了胚乳结构形成过程。结果表明，灌浆期不同时段的低温处理，对籽粒的粒型、垩白面积、胚乳结构三者的影响趋势基本一致，使籽粒外形异常，垩白面积提高；复粒和单粒淀粉体的体积变小且彼此差异变大，排列变疏松；复粒淀粉体变少，单粒淀粉体变多。低温处理愈早，对胚乳结构的影响愈大。灌浆前期进行低温处理、以后在正常温度下灌浆成熟的籽粒，其强势粒的粒型、垩白面积、胚乳结构均无明显改变，但弱势粒的变化较大。     

分子标记辅助选择改良特青及其杂交稻米的蒸煮与食味品质

特青是我国育成的一个超高产籼稻常规品种，同时也可作为两系杂交稻的重要亲本，但其直链淀粉含量较高，蒸煮与食味品质较差。采用水稻蜡质基因内的一个分子标记（称为PCR-AccⅠ）进行辅助选择育种，经回交转育向特青品种导入来自中等直链淀粉含量优质籼稻的Wx基因，选育了仍保持原有亲本主要农艺性状的3个优质品系特青TT-1、特青TT-2和特青TT-3。改良品系胚乳中Wx基因表达量较改良前明显下降，直链淀粉合成大幅减少，由改良前的28.5%成功下调至15%左右的中等偏低水平。用改良品系与培矮64S所配两系杂交组合仍能保持较高的结实率及其他优异农艺性状，而杂交稻米的直链淀粉含量明显改善。直链淀粉含量降低后对亲本及杂种稻米中胶稠度等其他蒸煮食味品质的改善也有明显作用。     

大米陈化过程中的组织学变化研究

运用组织切片的方法，对大米陈人过程中的胚乳细胞变化进行了观察及分析，指出了大米陈化过程中的组织学变化是导致大米食用品质下降的直接原因，运用酶处理是改变陈米组织结构，提高米饭食用品质的直接和有效的途径。