利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术提高贵州禾产量研究

以贵州禾糯稻黎平杂边禾为研究材料,设计水稻产量控制关键基因OsCKX2的CRISPR/Cas 9编辑特异性靶点序列,构建水稻OsCKX2基因的CRISPR/Cas 9定点编辑载体,并利用农杆菌介导法导入黎平杂边禾,通过潮霉素筛选及PCR分子检测,获得20个独立的转基因植株。对筛选获得的转基因T_0代植株基因进行测序比对,获得7株OsCKX2基因靶位点被编辑的突变转基因植株。对纯合的突变体T_1代植株农艺性状进行分析发现,与野生型黎平杂边禾相比,突变体的穗粒数增加16.67%,单株产量增加25.03%。本研究获得了产量增加的黎平杂边禾基因编辑的新种质。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsGPRP家族基因突变体

本研究利用CRISPR/Cas9技术对水稻OsGPRP家族基因进行敲除,在3个水稻OsGPRP基因的第一个外显子PAM序列区域各设计一个靶位点,并将3个靶位点的sg RNA进行串连,成功构建了3个OsGPRP基因同时敲除的CRISPR/Cas9载体;采用根癌农杆菌介导的遗传转化获得了60株T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序分析,我们获得了2种不同类型的OsGPRP3单基因突变材料;6种不同类型的OsGPRP2/OsGPRP3两基因突变植株;1种类型的OsGPRP1/OsGPRP3两基因纯合突变植株和4种不同类型的OsGPRP1/OsGPRP2/OsGPRP3三基因突变材料,为进一步研究OsGPRP家族基因的生物学功能及其相互关系提供遗传材料。     

CRISPR/Cas9技术编辑RMS2基因及其利用

水稻雄性不育是杂交水稻杂种优势利用的基础。为了推动粳型第三代杂交水稻育制种技术的发展,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对普通隐性核雄性不育基因RMS2进行定点编辑。根据CRISPR/Cas9基因编辑原理,以RMS2作为靶标基因,在基因第一和第二外显子分别选择正反向靶位点,在NCBI数据库利用BLAST工具分析靶位点特异性,最终构建一个双靶点的CRISPR/Cas9敲除载体。以粳稻品种‘中花11’作为受体,使用农杆菌遗传转化法转化受体获得21株T0代转化苗,通过对潮霉素抗性基因进行检测获得17株阳性苗。对17株阳性苗的2个靶位点分别进行测序分析,有13株在靶位点1发生编辑,突变频率为76.4%。全部植株都在靶位点2被成功编辑,突变频率为100%。不同靶位点发生的突变样式有较大差异。设计InDel标记用于重点株系10的分子标记辅助选择育种,最终获得无T-DNA成分的普通粳稻核不育系。本研究创制的新的rms2突变体和不含转基因成分的rms2粳稻不育系,不仅丰富了rms2的突变类型,也为进一步研究GDSL脂肪酶功能和粳型第三代杂交水稻创制了重要的材料。     

应用CRISPR/Cas9系统编辑水稻SBE3基因获得高抗性淀粉水稻新品系

SBE3是位于水稻第2号染色体上的水稻淀粉分支酶基因,该基因表达量的降低引起水稻抗性淀粉(resistant starch,RS)含量的提高。本研究应用CRISPR/Cas9系统对SBE3基因进行编辑,根据基因编码区序列(CDS)在第8外显子区域设计长度为20 bp的引导序列,化学合成引导序列并构建成sgRNA,将其插入到Cas9质粒骨架载体中,转化农杆菌。通过农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的p CAMBIA1300:SBE3sgRNA:Cas9表达载体转入水稻受体材料沪LPR18中。使用PCR扩增转基因阳性植株中含有CRISPR/Cas9靶点的片段并测序验证,确定12个突变单株,其中2个是纯合型,通过后代分离,得到没有潮霉素基因筛选标记的SBE3纯合突变单株,测定其抗性淀粉含量高达10%以上。以上结果表明,本研究已经通过CRIPR/Cas9技术获得稳定的高抗性淀粉水稻纯合突变体材料,为高抗性淀粉育种提供了新的种质资源和创建方法。     

利用基因编辑技术培育糯性水稻

为建立糯稻品种培育新体系,本试验研究了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对Waxy(Wx)基因定向突变进而培育糯稻的效果。在Wx基因的第2、第7、第8、第10、第11和12外显子区域设计6个靶位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体,采用农杆菌介导法将基因编辑载体转入粳稻品种哈勃601,获得11~88株转基因再生植株。突变分析表明,转基因株突变率总体偏低(0%~30.77%),仅在第2、第7和第11外显子上发生突变,以1~2 bp的插入缺失为主,都为纯合或双等位突变。5份纯合T2突变体的稻米呈蜡质状,直链淀粉含量为由亲本的15.5%降至2.0%~2.6%,接近或达到糯稻水平,其RVA谱与糯稻对照相仿,淀粉粘滞性较亲本哈勃601显著下降。上述结果表明,通过利用CRISPR/Cas9可对Wx基因进行定向突变从而获得糯性材料,但在利用该技术培育新品种时,需要选择适当的靶位点并培育较多的突变体,才能从中选到符合国家标准的糯稻品种。本研究对利用基因编辑技术培育水稻新品种提供了科学依据。     

水稻膜联蛋白基因OsAnn8干旱和低温条件下表达模式以及CRISPR/Cas9定点编辑

为了阐明水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在干旱和低温胁迫条件下的功能作用机制,通过荧光定量PCR技术对不同干旱和低温处理下的水稻叶片中OsAnn8基因进行转录水平上的定量分析,结果表明,OsAnn8基因在干旱胁迫处理前后表达量呈现出高-低-高的变化趋势,而在冷胁迫处理前后表达量则呈现出低-高-低-低的变化。随后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsAnn8基因进行定点编辑,并借助农杆菌介导将OsAnn8基因靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体导入转基因受体品种TP309,经潮霉素筛选后共获得32株转基因阳性植株,靶位点扩增测序峰图分析表明其中的2个单株出现了重叠峰,进一步的T载体克隆分别测序表明,这2个单株为单等位基因敲除,说明本研究已经成功获得了OsAnn8基因靶位点敲除的单等位突变体,不同类型的水稻OsAnn8基因突变体的创建,为水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在非生物胁迫条件下的功能研究奠定了材料基础。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsIPCS家族基因突变体

肌醇磷酸神经酰胺合酶(inositol phosphoryl ceramide synthase,IPCS)是植物鞘脂合成途径中的一种关键酶,在植物生长发育和逆境适应中具有重要作用。本研究在OsIPCS基因外显子区域设计带有PAM序列的靶位点,利用PCR扩增获得OsIPCS基因sg RNA表达盒,并成功构建CRISPR/Cas9敲除载体;采用根癌农杆菌介导的遗传转化获得3个OsIPCS基因的T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序确定突变类型,其中2株不同突变类型的OsIPCS1突变单株,27株不同突变类型的OsIPCS2突变单株,9株不同突变类型的OsIPCS3突变单株,为进一步开展OsIPCS基因功能的研究提供科学依据。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑水稻赤霉素2氧化酶基因OsGA2ox10

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,以粳稻品种‘沈农265’为遗传背景对水稻赤霉素2氧化酶基因OsGA2ox10进行编辑,获得了该基因编码序列翻译提前终止纯合突变体ga2ox10-1、ga2ox10-2和ga2ox10-3。经RT-PCR检测突变体中OsGA2ox10基因表达量相比野生型极显著降低。表达模式分析显示该基因在根、茎、叶、叶鞘、幼穗中均有表达,其中在幼穗中表达量最高。亚细胞定位结果显示OsGA2ox10与GFP融合蛋白定位于细胞质中。本实验的开展为进一步明确GA2ox10基因功能和该基因在赤霉素代谢失活调控网络中的作用提供了依据。     

基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T_0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T_1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T_1不含荧光的种子进行培育得到的T_2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。     

利用CRISPR/Cas9技术对水稻香味品质进行遗传改良

为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P0.05),2个突变单株达到阳性对照(信香粳1号)水平,其中1个相比阳性对照显著提高。通过对6个突变株系的T_1主要农艺性状的调查发现,3个株系在香味物质含量提高的同时主要农艺性状和野生型没有显著差异。进一步对T_1植株进行筛选,共获得了无转基因序列的突变单株10个。综上,利用CRISPR/Cas9技术成功对超级稻品种龙粳31的香味品质进行了遗传改良,实现了香味物质含量的显著提高,为香稻和超级稻的育种提供了基础材料。     

利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体

为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑Badh2基因改良粳稻香味

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。     

CRISPR/Cas9介导的拟南芥TT1基因的敲除

在菜油品质上黄籽相较于褐籽更为优良,且更易于合成高质量的生物柴油。已有研究表明TT1(TRANSPARENT TESTA 1)基因是类黄酮代谢途径中的关键基因,为了通过CRISPR/Cas9基因编辑载体验证TT1基因在白菜型油菜中的功能,本研究先在拟南芥中进行了TT1基因的编辑。构建了CRISPR/Cas9 TT1基因编辑载体,通过农杆菌介导侵染拟南芥花序的遗传转化方式将编辑载体引入拟南芥Columbia生态型,通过表型观察发现T1代12株阳性苗中产生了11株表型株,其中1株表现为褐籽,2株表现为黄籽,9株表现为黄籽和褐籽的嵌合。测序检测分析其突变型结果发现,TT1靶位点处有单碱基缺失、单碱基插入、多个碱基缺失、碱基缺失后插入以及两个靶位点之间多个碱基缺失的多种突变类型。T2代获得一株纯合突变体,TT1两个靶位点之间产生79 bp的碱基缺失,且全株表现为黄籽。本研究为CRISPR/Cas9载体在白菜型油菜中TT1基因功能验证提供借鉴,并为其它作物TT1同源基因的功能验证提供了新的突变体材料。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻miR1866突变体构建

microRNA(miRNA)是长度为18~25个碱基的非编码单链RNA,在植物生长发育过程中起着重要的调节作用。水稻是世界上重要的粮食作物之一,近年来调控水稻生长发育的miRNA不断被发掘,但目前关于miR1866的研究还比较少。本研究通过构建miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,创制miR1866的突变体,挖掘水稻miR1866的功能。依据CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计了miR1866的突变靶点,通过人工合成的方法得到包含突变靶点的特异序列,经过磷酸化修饰和退火后与载体Sg RNA连接进而与Cas9重组得到miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,获得转基因植株,结合测序结果判断转基因植株突变单株的突变基因型。本研究比较了野生型和突变体(KO1866-1-2和KO1866-2-4)在相同培养条件下苗期的根长、株高、茎基粗、鲜重和干重,结果表明:在营养液培养条件下,突变体的株高、根长、茎基粗、鲜重和干重均显著低于野生型。据此推测,miR1866对水稻的生长发育有一定的调节作用。本研究利用CRISPR/Cas9创制水稻miR1866的突变体,对研究miRNA调控途径,完善水稻miRNA调控的分子机制具有重要的意义。     

利用CRISPR/cas9技术研究铁皮石斛Csl4基因的功能

为了研究铁皮石斛类纤维素合成酶基因的功能和利用类纤维素合成基因培育低纤维素新品种提供基础,本研究通过从铁皮石斛转录组中选取茎中表达量较高的类纤维素合成酶DeCsl4基因,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,获得了Csl4基因突变株。测序结果表明,目的基因靶位点序列发现有7个碱基的缺失,其中2个碱基因缺失发生在外显子上。突变植株纤维素含量的测定结果表明,平均纤维素含量(12.95 mg/g)显著低于正常植株(32.16 mg/g),说明DeCsl4基因的突变能降低铁皮石斛茎干中纤维素的合成。本研究结果首次表明CIRISPR/Cas9技术能成功的编辑兰科植物,这为以后研究兰科植物基因功能运用提供技术支撑。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥MS2基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9)基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场重大的技术革命,它比锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用到植物科学研究领域中。本实验选取拟南芥MS2为目的基因,构建植物基因编辑系统的表达载体,并通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,从而利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除拟南芥MS2基因。对转基因后代的MS2测序结果分析表明,在获得的12个阳性转化植株中,发现了5个阳性植株存在基因序列上的新碱基插入,由此形成CRISPR/Cas9介导的拟南芥MS2突变体。这一工作为后续分析其他物种中MS2同源基因的功能研究提供参考依据。     

利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术定向敲除烟草eIF4E-6基因

马铃薯Y病毒(PVY)是危害烟叶生产的主要病害之一。已有研究表明,烟草对PVY的抗性由隐性抗性基因e IF4E-6控制。本研究利用CRISPR-Cas9技术定向敲除烟草e IF4E-6基因以改良优质烤烟品种K326的PVY抗性。我们构建了2个特异靶向e IF4E-6基因的CRISPR-Cas9载体g1和g2。构建的载体转化烟草品种K326,PCR检测潮霉素B抗性标签鉴定阳性T0代转基因烟草。PCR扩增阳性转基因烟株靶位点周围DNA序列,对PCR产物进行直接测序或克隆测序,筛选自靶位点处发生突变的烟株,得到2个载体各约50株阳性转化T0代烟株。序列分析结果表明,有2株g1载体转化的烟株在靶位点处出现杂合型单碱基缺失,分别有3和4株g1和g2载体转化的烟株在靶位点处出现杂合型1~2个碱基的替换。这些目的基因杂合型突变的T0代烟株为后续自交获得目的基因纯合敲除后代材料并最终获得PVY抗性改良的烟草提供了研究基础。     

OsGA200x2不同长度RNAi片段对水稻株高等农艺性状的遗传效应

利用OsGA20ox2基因序列构建不同长度的RNAi片段并导入水稻,获得不同高度的矮化植株.将这些矮化植株与野生型植株回交获得B1F2群体,卡方检测表明B1F2群体矮秆植株数和高秆植株数符合3∶1比例,表现为矮秆显性的遗传规律.对矮化植株的F5和B1F2群体株高、各茎节间长度和一些主要农艺性状方差分析显示,OsGA20ox2基因的RNAi能显著缩短株高和各节间长度(P＜0.05),RNAi干扰片段越长,使植株株高和节间长度缩短程度越大,可使株高降低24～42 cm,矮化22％～39％.在同一长度的RNAi干扰片段下,倒一节节间长度平均缩短与倒二节节间长度平均缩短非常相近,倒三节和倒四节节间长度平均缩短非常相近,总的缩短程度是倒四节＞倒三节＞倒二节＞倒一节.这种近基部节间长度缩短幅度和比例较大的特点,利于提高水稻的抗倒伏能力,同时上部节间缩短幅度和比例较小,有效地保持合理株高,不使生物产量明显降低,有利于水稻的稳产和高产.OsGA20ox2基因的RNAi不影响千粒重、结实率、穗长等主要农艺性状或影响很小.