转mCherry基因水稻的遗传分析及T-DNA整合位点的研究

为了建立转基因水稻的高通量遗传分析系统,本研究以粳稻成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料,潮霉素磷酸转移酶(HPT)为抗性筛选标记,通过农杆菌介导的方法将红色荧光蛋白基因mCherry导入水稻。在水稻转化愈伤组织、转化植株(T0)和转基因后代(T1)均检测到红色荧光,证实mCherry在转基因水稻中稳定表达。139个独立转化株系的遗传分析表明,mCherry在转基因后代表现多种遗传模式,54%的转基因株系呈单位点遗传。TAIL-PCR进一步验证转基因整合到水稻基因组。根据T-DNA整合位点DNA序列分析结果,T-DNA左边界发生碱基缺失、增加和替换,右边界只发生碱基缺失,说明左边界比右边界有更多的碱基变异类型。此外,对T2代植株mCherry和HPT的转录水平进行实时定量逆转录PCR分析,结果表明,mCherry和HPT转录水平因T-DNA在水稻基因组中的整合位置而变化,表现位置效应。本研究在mCherry荧光蛋白和其它相关方法的基础上,为转基因水稻遗传及分子分析建立了一个高效的流程体系。     

浙江省12个常规晚粳稻品种抗稻瘟病基因的分子检测

为进一步明确浙江省常规晚粳稻品种中稻瘟病抗性基因的分布情况,本研究利用Pi2、Pi9、Pi5、Pi40、Pib、Pita、Pi25、Pi41、Pikm和Pigm 10个抗瘟基因的功能标记,对12个常规晚粳稻主栽品种进行分子标记检测。结果表明,Pib、Pi25、Pi40和Pi41等4个抗性基因在这些供试品种中的分布频率高达100%;Pi2和Pikm的分布频率均为58.33%,Pita、Pi5、Pi9和Pigm的分布频率分别为50.00%、33.33%、25.00%和0;12个供试水稻品种中,‘浙粳29’、‘浙粳86’、‘浙粳99’和‘秀水134’含抗性基因多达7个,而‘浙粳88’含抗性基因仅有5个。在遗传相似系数为0.877处,‘浙粳99’、‘浙粳86’、‘嘉58’和‘秀水134’可以聚为一类,说明‘浙粳99’和‘浙粳86’对稻瘟病有较强抗性。本研究初步确定了12个浙江省常规晚粳稻品种的抗性基因分布情况,研究结果可为进一步聚合更多的稻瘟病抗性基因、培育广谱抗稻瘟病新品种(系)新品种提供了科学基础。     

利用农杆菌介导法将反义Wx基因导入水稻的研究

利用根癌农杆菌将含多基因(hpt选择标记基因、反义Wx基因、GFP和GUS报告基因)的pCAMBIA1304载体导入水稻品种(501R、中花9号和日本晴)的幼胚愈伤组织,分别在含35mg/L、45mg/L和65mg/L潮霉素浓度的筛选培养基上筛选获得抗性愈伤。后经PCR检测,从415株T0代再生植株中选出92株(其中501R、中花9号和日本晴分别为4株、43株和45株)。对这些转基因后代植株进行Southern blotting分析表明：hpt、反义Wx基因已经整合进植物基因组中。绝大多数转基因植株后代的表型正常。成熟种子直链淀粉含量分析表明,部分转基因植株的T1代种子中的直链淀粉含量有不同程度的下降,最低的已下降至6．3％,与对照相比下降了9．8％。     

无选择标记基因的优质香稻新品系培育

香味是稻米食味品质的主要性状之一,为培育无抗性选择标记基因的优质香稻新品系,以携带有超双元载体OSBADH2-RNAi的农杆菌菌株EHA105介导,将OSBADH2基因的RNA干扰结构和潮霉素抗性选择标记(HPT)基因同时导入优质粳稻武育粳3号成熟胚来源的愈伤组织中,经过在含有潮霉素的培养基上筛选和分化,获得了54个独立转化子,其中36个转化子同时含目的基因和HPT基因,共转化频率为66.7%;从这些转化子的后代中共筛选获得25个去除HPT基因的转化子,去标记频率为69.4%;通过KOH法等4种方法进行香味的鉴定,获得15个具有香味的株系。实时定量PCR分析结果表明,具香味株系中的OSBADH2基因的表达受到了明显抑制,进一步证明了香味的产生是由于OSBADH2基因被干扰而引起。农艺性状调查表明,抑制OSBADH2基因的表达对水稻产量相关性状,包括株高、千粒质量、穗粒数和结实率影响不明显。     

运用农杆菌介导法将PTA和反义Wx双基因导入水稻的研究

利用根癌农杆菌将含多基因(hyg选择标记基因、反义Wx 基因、PTA基因、GFP和GUS报告基因)的pCAMBIA1304载体导入水稻品种(501R、中花9号和日本晴)的幼胚愈伤组织,分别在含35mg/L、45mg/L和65mg/L潮霉素浓度的筛选培养基上筛选获得抗性愈伤。后经PCR检测,从415株T0代再生植株中选出92株(其中501R、中花9号和日本晴分别为4株、43株和45株)。对这些转基因后代植株进行Southern blotting分析表明：hpt、反义Wx 和 PTA基因已经整合进植物基因组中,绝大多数转基因植株后代的表型正常。成熟种子直链淀粉含量分析表明,部分转基因植株的T1代种子中的直链淀粉含量有部分程度的下降,最低的已下降至6.3%,与对照相比下降了9.8%。     

利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体

为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。     

分子标记辅助选育聚合抗稻瘟病基因Pi5及Pita的水稻新品系

稻瘟病是对水稻生产具有严重威胁的真菌病害,选育并推广聚合多个抗稻瘟病基因的抗病品种是防控该病最为经济有效的途径。本研究以携带不同抗稻瘟病基因的‘吉粳105’(Pita)和‘T639’(Pi5)为亲本杂交衍生的后代群体为试材,利用分子标记辅助育种技术,筛选到3个聚合抗稻瘟病基因Pita和Pi5的后代。并以其中一个株系‘吉2011TK50’为试验材料,利用人工接种鉴定、显微观察及定量PCR等技术研究‘吉2011TK50’的抗病表型及抗性分子机制。结果表明,抗稻瘟病基因的聚合能够增强该品系对稻瘟病的抗性。显微观察和抗稻瘟病基因表达分析发现,基因聚合株系在接种稻瘟病菌后24 h PR基因表达量显著升高,被稻瘟病菌侵染的细胞开始出现过敏性死亡等抗病反应,抑制了稻瘟病菌的进一步侵染。研究结果证实聚合Pita和Pi5可提高水稻品种对抗稻瘟病的抗性,这可为抗病基因聚合育种提供参考。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在转基因玉米中的表达

本研究拟构建携带猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白基因(TGEV-S)的转基因玉米植株并检测其表达情况。首先利用PCR方法自携带TGEV-S基因的重组质粒中扩增2.2kb的S基因片段,然后插入植物表达载体pBAC176中,该表达载体以编码除草剂草甘膦抗性的EPSP基因作为选择标记,目的基因以双增强子的CaMV35S(E35S)及其玉米Hsp70第一内含子为驱动。以授粉后10～12d约0.5～1mm大小的玉米幼胚为受体,用基因枪进行转化,经过愈伤组织诱导、草甘膦抗性筛选和分化再生培养,先后获得74株转化再生植株。利用PCR和Southern blot检测表明,T0代转基因苗有9株检测结果为阳性。T1代转基因玉米株系经PCR检测有14个转基因株系为阳性,初步确定了目的基因在这些转基因玉米中的稳定整合。进而通过间接ELISA分析初步确定目的基因在7个T1代转基因玉米株系获得了表达。研究结果为进一步研究表达TGEV-S转基因玉米的生物学活性奠定了基础。     

利用分子标记辅助选择技术创制抗稻瘟病水稻新恢复系

为了选育出抗病的优良杂交水稻恢复系,本研究以含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻材料75-1-127为供体,以杂交水稻强恢复系蜀恢527、明恢86、闽恢3301和X5为受体亲本,运用分子标记辅助选择技术与回交、复合杂交的选育方法,同时连续4年在稻瘟病重发区田间自然诱发鉴定,最终获得了6份含有抗稻瘟病基因Pi9的新株系,其中2份表现抗稻瘟病,4份表现中抗稻瘟病,而不含有Pi9基因的株系材料均表现中感病及以上。结果表明,在相同遗传背景下含有Pi9基因的株系的抗性水平明显优于不含有Pi9基因的株系。本研究利用分子标记辅助选择技术有效地培育了抗稻瘟病的水稻恢复系。     

广谱抗稻瘟病基因Pi9对籼稻的转化研究

通过农杆菌介导法，将由CaMv35s启动子启动的广谱抗稻瘟病基因Pi9转入5个籼稻品种（丰源B、湘晚籼13号、R996、527、1701）的愈伤组织中，所用质粒为pCAMBIA1301，pCAMBIA1301的T-DNA区含有潮霉素（hygmycin）抗性基因和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因。以潮霉素作为筛选剂对籼稻愈伤组织进行筛选，结果表明，不同品种在转化过程中抗性愈伤率在73．9％～83．3％之间，获得的部分抗性苗经PCR检测为阳性，阳性植株的转化率差异显著，其转化率为5．7％～25．9％之间，对获得的抗性苗和T2代幼苗的根和叶进行GUS组织化学染色分析，有些抗性苗和T2代幼苗的根和叶呈蓝色反应，表明广谱抗稻瘟病基因Pi9基因己整合到水稻基因组并能正常表达。对T2代进行稻瘟病小种接种试验，结果显示了抗性分离。并且建立了一套较为有效的水稻遗传转化体系。     

反义外壳蛋白基因介导的抗SCMV转基因玉米研究

玉米矮花叶病（MDM）是一种世界性病害，在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)所致。为探索一条高效、安全的抗SCMV转基因途径，构建了无标记基因的SCMV反义外壳蛋白基因（cp）表达载体pACP。通过冻融法将该载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农杆菌LBA4404,然后共转化玉米自交系综3的幼胚。通过除草剂梯度筛选，从抗性愈伤组织分化获得了35株再生苗。PCR检测证明，其中26株带有抗除草剂标记基因（bar），14株带有SCMV反义cp基因。这14株带有目的基因的玉米植株自交，其种子在田间种植成株行（T₁代）。玉米T₁代幼苗人工接种SCMV，筛选出2个抗病株率高于70%的株行。ELISA检测表明，抗病株SCMV含量极低，抗性达高抗水平。PCR检测表明，抗病性是反义cp基因作用的结果，并且获得了2株cp基因阳性而标记基因阴性的抗病株。     

水稻抗稻瘟病基因Pi35功能性分子标记的开发及其应用

稻瘟病是水稻生产上的严重病害,利用抗病基因培育抗病品种是控制稻瘟病最经济而有效的措施。在日本,稻瘟病部分抗性基因Pi35作为广谱持久抗性基因已广泛应用于水稻育种和稻瘟病防治实践。但是,Pi35基因在我国的资源和品种中的分布情况不清,制约了这一重要基因在我国育种实践中的应用,急需开发实用的分子标记,并系统研究该基因在我国的品种及其亲本中的分布情况,为稻瘟病抗性育种服务。本研究通过比对抗、感品种中Pi35等位基因序列,发现一个能检测抗、感病性差异的特异SNP(3780 T),并据此开发了Pi35基因的功能性分子标记Pi35-d CAPS。利用该标记检测了抗源藤系138的衍生品种10份、微核心种质204份和主栽品种67份,结合测序鉴定,确认5份藤系138衍生品种(垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号和龙粳34)及2份微核心种质(粳稻品种抚宁紫皮粳子和籼稻品种细麻线)携带Pi35基因。本研究结果为通过分子育种手段高效利用Pi35基因改良我国水稻(特别是籼稻)品种的稻瘟病抗性提供了手段。     

无抗性选择标记转基因软米和糯稻新品系的选育及中间试验

直链淀粉含量是影响稻米品质的最重要因素之一。为培育直链淀粉含量较低的软米和糯稻新品系,在经共转化法获得的转反义Wx基因水稻自交后代中筛选获得国不含抗性选择标记基因的纯合体.对这些纯合转基因水稻的分析表明,其未成熟种子胚乳中Wx基因表达水平和成熟种子中Wx蛋白量较未转化对照有不同程度的降低。转基因水稻成熟种子中直链淀粉含量较未转化对照有不同程度的下降,2个转基因系降低至10%左右,相当于软米的直链淀粉含量,1个转基因系降到了2%以下,形成了糯稻新品系。转基因稻米中直链淀粉含量降低后,其胶稠度相应变软,而糊化温度未发生明显改变。田间试验结果表明,转基因水稻的大部分农艺性状与受体品种武香粳9号无显著差异。因此,本研究成功培育了无抗性选择标记且淀粉品质改良的转反义Wx基因水稻新品系。     

Marker‐assisted selection for rice blast resistance genes Pi2 and Pi9 through high‐resolution melting of a gene‐targeted amplicon

The use of host resistance (R) genes is considered the most cost‐effective option to control the rice blast disease. The two allelic R genes Pi2 and Pi9 confer very broad‐spectrum resistance against blast isolates collected worldwide. However, the two genes have not yet been widely deployed in rice breeding programmes. Availability of specific markers for them would facilitate incorporating the two R genes into new rice lines through marker‐assisted selection. Herein, we report the development and utilization of a robust and specific marker for the Pi2 and Pi9. This marker was derived from polymorphisms within the target gene, and achieved simultaneously distinguish Pi2 and Pi9 from other alleles through high‐resolution melting of a small amplicon. With the marker, we were able to transfer the Pi2 into an elite restorer line through marker‐assisted backcrossing, successfully obtained effective resistance to blast disease, and we were also able to, respectively, incorporate the Pi2 and Pi9 with two other R genes. As the additive effect, blast resistance in these stacking lines harbouring three R genes were significantly improved.     

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta的分子标记辅助选择

利用已建立的水稻抗稻瘟病基因Pi-ta显性分子标记对30个品系和157个来自不同国家的一些水稻品种进行分子鉴定,并采用稻瘟病菌菌株ZN57（IC-17）和ZN61（IB-49）人工接种试验进行致病性测试。结果表明,大部分品系和少数水稻品种含抗病基因Pi-ta,且对稻瘟病菌菌株ZN57和ZN61表现抗病反应。除此之外,利用两对显性分子标记YL1     

转sbk和sck基因提高水稻Dular的抗虫能力

将抗病虫基因与广亲和基因聚合在一起可为两系杂交稻更广泛的应用奠定基础。本研究将去选择标记的包含2个抗虫基因(sbk和sck)的质粒载体(pCDMARUBA-Hyg)采用根癌农杆菌介导法转入兼抗水稻条纹叶枯病的广亲和水稻品种Dular中。通过常规PCR检测,获得18份不具有选择标记的转基因阳性植株,Southern杂交分析结果表明其中15份为单拷贝插入,对这15份单拷贝转基因植株进行RT-PCR分析,结果抗虫基因都能正常表达。人工接虫鉴定结果表明,转入抗虫基因显著提高了水稻品种Dular抗螟虫的能力;同时利用Dular本身的广亲和基因(S5n)标记和与抗条纹叶枯病基因(qSTV-11b和qSTV-11c)的连锁标记进行分子检测,其结果表明这15份单拷贝转基因植株都具有广亲和与抗条纹基因的特征带;与不同籼稻和粳稻配组杂种F1的结实率和条纹叶枯病在田间自然发病状况下的调查结果表明,这些单拷贝植株不但具有广亲和与抗水稻条纹叶枯病的能力,而且其抗螟虫能力显著提高。     

Mapping of a blast field resistance gene Pi39(t) of elite rice strain Chubu 111

We investigated the mode of inheritance and map location of field resistance to rice blast in the elite rice strain Chubu 111, and yield under severe blast conditions. Chubu 111 carries the complete resistance gene Pii, although field testing showed this strain to be susceptible to infection. The level of field resistance of Chubu 111 was so high that chemicals used to control blast were not required, even in an epiphytotic area. Genetic analysis of field resistance to blast in 149 F₃ lines derived from a cross between Chubu 111 and the susceptible cultivar ‘Mineasahi’ suggested that field resistance is controlled by a dominant gene, designated Pi39(t), that cosegregates with the single sequence repeat marker loci RM3843 and RM5473 on chromosome 4. Comparative studies of polymorphism at RM3843 among Chubu 111 and six cultivars or lines in its pedigree suggested that the donor of the resistance gene was the Chinese cultivar ‘Haonaihuan’. Marker‐assisted selection of Pi39(t) should be useful in rice‐breeding programmes for field resistance to blast.