根癌农杆菌介导转化籼稻影响因素的研究

选用我国籼型杂交稻中的几个重要亲本 ,以携带有双元载体 p CAMBIA1 3 0 1的根癌农杆菌 EHA1 0 5为载体 ,以GUS基因的瞬间表达为依据 ,研究根癌农杆菌介导转化籼稻的影响因素 ,确立对转化频率有重要影响的几个条件。结果表明 :经短期预培养 (4～ 5d)的幼胚是较为理想的转化受体材料 ;在共培养基中添加较高浓度的乙酰丁香酮 (3 0 0～ 4 0 0μmol/ L)可提高 GUS基因的瞬间表达频率 ;以 CC培养基作为共培养后抗性愈伤筛选的基本培养基有利于抗性愈伤组织的筛选培养。按此确立的条件 ,在特青、龙特甫 (B)、珍汕 97(B)、盐恢 559等籼稻品种或亲本中的 GUS瞬间表达率高达 80 % ,抗性愈伤组织转化率高达 70 %     

水稻分支酶基因 Sbe1和 Sbe3 cDNA的克隆及全序列分析

 通过改良的RT PCR法合成了水稻未成熟种子胚乳cDNA库，并以此为模板，用PCR技术从粳稻品种武运粳7号中克隆了分别编码淀粉分支酶SBEⅠ和SBEⅢ的2个基因Sbe1和Sbe3。序列分析表明，克隆Sbe1和Sbe3基因的大小分别为2490 bp和2481 bp，包含了基因完整的编码序列。Sbe3基因与已发表基因全序列完全相同，同源性达100%；Sbe1基因与已发表基因序列有4个碱基不同，同源性为99.84%，推导氨基酸序列的差异为2个。     

分子标记辅助选择改良特青及其杂交稻米的蒸煮与食味品质

特青是我国育成的一个超高产籼稻常规品种，同时也可作为两系杂交稻的重要亲本，但其直链淀粉含量较高，蒸煮与食味品质较差。采用水稻蜡质基因内的一个分子标记（称为PCR-AccⅠ）进行辅助选择育种，经回交转育向特青品种导入来自中等直链淀粉含量优质籼稻的Wx基因，选育了仍保持原有亲本主要农艺性状的3个优质品系特青TT-1、特青TT-2和特青TT-3。改良品系胚乳中Wx基因表达量较改良前明显下降，直链淀粉合成大幅减少，由改良前的28.5%成功下调至15%左右的中等偏低水平。用改良品系与培矮64S所配两系杂交组合仍能保持较高的结实率及其他优异农艺性状，而杂交稻米的直链淀粉含量明显改善。直链淀粉含量降低后对亲本及杂种稻米中胶稠度等其他蒸煮食味品质的改善也有明显作用。     

转反义 Wx基因糯稻的显性遗传及对稻米粒重的效应分析

 利用直链淀粉含量下降至 2 %左右的 3个转反义Wx基因糯稻为研究材料 ,较为系统地分析了转基因糯稻的遗传及其直链淀粉含量下降后对于稻米粒重的影响。结果表明由转基因技术获得的糯性性状与其它转基因性状一样 ,表现为显性遗传 ,这与一般的糯性变异不同。导入反义Wx基因使直链淀粉含量从 17%下降至糯稻水平时 ,其稻米粒重相应降低 6 %～ 8% ,且下降幅度与直链淀粉含量的下降幅度呈显著正相关。小区试验结果表明 ,由此获得的转基因糯稻仍具有原受体亲本的高产潜力 ,利用转基因技术培育既高产又优质的水稻品种 ,尤其是高产糯稻新品种是切实可行的     

分子标记辅助选择降低籼稻057的直链淀粉含量

 以4种低直链淀粉含量（AC）的籼稻品种(R367、91499、盐恢559、恢527)作优质基因的供体，以产量配合力较强的三系籼稻恢复系057为受体轮回亲本，对高AC值的057进行回交改良。在回交改良中利用分子标记对控制AC值的基因型进行选择，并对分子标记鉴定的Wx基因3种表达类型（GG、TT、GT）植株稻米的AC值进行测定分析。结果显示，GG型植株的稻米AC值高于20%；GT型的变化较大，为17.71%~28.48%；TT型的小于18%。经最小显著差数法（LSR）检验，3种基因型间AC差异达极显著水平。表明这种分子标记对稻米AC值的辅助选择是可靠有效的。通过分子标记辅助选择有效降低了057的AC值。     

无抗性选择标记转基因软米和糯稻新品系的选育及中间试验

直链淀粉含量是影响稻米品质的最重要因素之一。为培育直链淀粉含量较低的软米和糯稻新品系,在经共转化法获得的转反义Wx基因水稻自交后代中筛选获得国不含抗性选择标记基因的纯合体.对这些纯合转基因水稻的分析表明,其未成熟种子胚乳中Wx基因表达水平和成熟种子中Wx蛋白量较未转化对照有不同程度的降低。转基因水稻成熟种子中直链淀粉含量较未转化对照有不同程度的下降，2个转基因系降低至10%左右，相当于软米的直链淀粉含量，1个转基因系降到了2%以下，形成了糯稻新品系。转基因稻米中直链淀粉含量降低后，其胶稠度相应变软，而糊化温度未发生明显改变。田间试验结果表明，转基因水稻的大部分农艺性状与受体品种武香粳9号无显著差异。因此，本研究成功培育了无抗性选择标记且淀粉品质改良的转反义Wx基因水稻新品系。     

根癌农杆菌介导转化籼稻影响因素的研究

选用我国籼型杂交稻中的几个重要亲本，以携带有双元载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌EHA105为载体，以GUS基因的瞬间表达为依据，研究癌农杆菌介导转化籼稻的影响因素，确立对转化频率有重要影响的几个条件。结果表明：经短期预培养（4－5d）的幼胚是较为理想的转化受体材料；在共培养其中添加较高浓度的乙酰丁香酮（300－400μmol/L）可提高GUS基因的瞬间表达频率；以CC培养基作为共培养后抗性愈伤筛选的基本培养基有利于抗性愈伤组织的筛选培养，按此确立的条件，在特青、龙特甫（B）、珍汕97（B）、盐恢559等籼稻品种或新本中的GUS瞬间表达率高达80％，抗性愈伤组织转化率高达70％。     

根癌农杆菌介导的水稻转化系统的优化及转反义Wx基因植株的获得

 以具不同直链淀粉含量的籼粳稻品种为受体材料，试验了适宜于根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织诱导培养基及其诱导培养的时间。结果表明，一种基于MS基本培养基的商品培养基较适合作为籼粳稻幼胚愈伤组织的诱导培养基；对于籼型杂交稻亲本协青早B，转化前幼胚较适合的愈伤组织诱导培养天数为8 d左右。在此基础上，将反义蜡质（Wx）基因分别导入上述受体亲本中，获得了一批转基因水稻植株。PCR和Southern杂交分析表明反义Wx基因已经整合进了转基因水稻的基因组中。遗传分析表明外源基因在转基因水稻后代中的分离符合3∶1的理论比例。     

利用分子标记技术降低协优57的直链淀粉含量

 为克服产量高、适应性广的中籼组合协优57的直链淀粉含量较高、蒸煮食味品质较差的缺点，对其父母本较高的直链淀粉含量特性进行了改良。先前利用PCR AccⅠ分子标记辅助选择对其父本057进行改良，育成了直链淀粉含量改良型057, 简称057(TT)。本研究以ND42为优质基因的供体，利用PCR AccⅠ分子标记对协青早B\[母本协青早A的保持系，简称协青早B(GG)\]进行改良，得到直链淀粉含量改良型协青早B，简称协青早B(TT)。然后用改良前、后的各亲本分别配组，分析各组合的基因型(GG、GT、TT)和食味品质。结果表明，改良单亲的GT型组合协青早B(GG)/057(TT)、协青早B(TT)/057(GG)杂交稻米的直链淀粉含量由原组合协青早B(GG)/057(GG)的26.1%分别降到19.3%和19.2%，但均一性较差。改良双亲的TT纯合型组合协青早B(TT)/057(TT)的杂交稻米，不仅直链淀粉含量降到中等偏低水平(12.5%)、胶稠度变得更软，而且直链淀粉含量的均一性也有了很大的提高。     

导入反义Wx基因改良杂交籼稻保持系直链淀粉含量

水稻胚乳中的直链淀粉含量是影响稻米蒸煮和食味品质的重要性状。试验了适合水稻冈46B和Ⅱ-32B品种进行遗传转化的外植体、培养基及光温条件，采用遗传转化技术将反义Wx基因导入生产上大面积应用的籼稻保持系冈46B和Ⅱ-32B，获得了转基因植株。PCR检测证明外源基因已整合进水稻的基因组。分析结果表明，纯合转基因水稻植株成