O型FMDV P1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒的构建及其在BHK-21细胞中的表达

为了构建O型FMDV P1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒并在BHK-21细胞中进行表达,本研究利用聚合酶链式反应(PCR)从阳性质粒pGEM-P12A克隆到P1-2A基因,将扩增产物纯化、双酶切后连接到pBudCE-IFN载体,构建重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A.重组表达质粒鉴定后,在脂质体介导下转染BHK-21细胞,用RT-PCR和直接免疫荧光试验分别检测P1-2A 和IFN-γ在BHK-21细胞中的表达.RT-PCR检测显示,重组表达质粒转染细胞后P1-2A 和IFN-γ基因成功转录出mRNA;免疫荧光试验表明目的基因在BHK-21细胞中获得了表达.结果证明,本研究成功构建了重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A并在体外进行了表达,这为研制抗FMDV DNA疫苗和IFN-γ的佐剂作用奠定了坚实基础.     

猪ATF4基因真核超表达载体的构建及鉴定

摘 要：通过克隆猪ATF4基因CDS,构建pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,为下一步在细胞水平和个体水平研究该基因功能奠定条件。提取RNA,运用RT-PCR技术和巢式PCR技术扩增猪ATF4全部编码序列,克隆转化到pMD18-T载体中,测序证实后,在克隆至真核超表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,并进行酶切和测序鉴定。在细胞水平上进行转染鉴定。成功克隆了ATF4基因,并构建了pcDNA3.1(+)-ATF4真核超表达载体,瞬时转染C2C12细胞,超表达效果明显。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

合作猪HMOX1基因过表达载体构建及组织表达分析

为了构建合作猪HMOX1基因过表达载体,并分析其组织表达特征,本研究通过PCR扩增获取合作猪HMOX1基因完整CDS区序列,将其插入到pcDNA3.1(+)过表达载体中,构建pcDNA3.1-HMOX1过表达载体;并通过实时荧光定量PCR检测HMOX1基因在合作猪心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠和背最长肌中的表达情况。结果显示,成功扩增出合作猪HMOX1基因924 bp的完整CDS区,通过双酶切和测序鉴定,HMOX1基因成功连接到pcDNA3.1(+)过表达载体中。组织表达结果显示,HMOX1基因在合作猪组织中表达量最高是脾脏,显著高于其它组织(P<0.05),其次是肝脏、肺脏、肾脏和心脏,在十二指肠中的表达量最低。研究结果为进一步研究HMOX1基因在合作猪高海拔低氧适应过程中的功能提供了重要参考。     

SPF鸡胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK细胞中的表达

为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3galⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染MDCK细胞,在G418的筛选下,获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和PCR检测,筛选可稳定表达St3galⅠ基因的细胞株。结果表明,从鸡胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo质粒,从而实现真核表达载体pCI-neo-St3galⅠ的构建。在G418选择压力下,初步获得了稳转目的基因的MDCK细胞系。将抗性细胞混合克隆进行稀释,经选择后挑选出30个单克隆抗性细胞株。分别以转染细胞基因组DNA和总RNA为模板,经PCR检测显示,目的基因已整合入MDCK细胞的基因组中并可稳定的进行表达。     

小鼠 Dazl 基因真核表达载体的构建及表达检测

为研究小鼠Dazl基因的功能及探究Dazl基因过表达在干细胞向生殖细胞分化过程中的作用,采用RT-PCR方法,从13．5 dpc 雌性胎鼠卵巢中克隆出Dazl基因的全部编码区,测序正确后利用限制性内切酶将其连接到真核表达载体pcDNA3．1上。线性化后对小鼠成纤维细胞进行转染,qRT-PCR及Western Blot 技术显示外源基因Dazl已经成功转染并表达。为研究Dazl基因的功能及干细胞向生殖细胞的诱导分化奠定了基础。     

猪OGP蛋白基因克隆及分泌载体的构建与鉴定

为了获得重组猪OGP蛋白,构建OGP分泌表达载体,以使猪输卵管特异性糖蛋白在体外受精中发挥重要作用。从猪输卵管中提取总RNA,运用RT-PCR技术扩增猪OGP全部编码序列,克隆到pET22b载体中,构建成pET22b-OGP分泌表达载体,对其进行酶切、PCR和测序鉴定。结果表明：成功构建了OGP分泌表达载体,为进一步研究该OGP在猪体外受精中的功能奠定了基础。     

猪α乳清蛋白基因双元载体的构建和转化拟兰芥植物

将人工合成的植物化的猪α乳清蛋白基因编码区克隆到载体中,构建了带有35 S启动子--猪α乳清蛋白基因--终止子表达单元的双元载体,采用农杆菌法对拟兰芥进行植物转化.利用该双元载体上的除草剂抗性基因(Bar基因)为选择性标记进行筛选,获得了一些抗除草剂的转化植株.对转化植株后代植进行猪α乳清蛋白基因的PCR检测,证实外源猪α乳清蛋白基因已整合到植物基因组DNA中.     

口蹄疫病毒3D基因真核表达载体pEGFP-3D的构建及其融合蛋白分子在BHK细胞中的定位

为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况.从重组质粒pMDl8.T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经Barn H Ⅰ/Hind Ⅲ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定.阳性质粒进行测序.利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞.免疫组化检测转染细胞中3D基凶表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达.结果表明,成功构建了重组表达质粒pEGFP-3D,并在BHK-21细胞中进行了表达.免疫组化分析表明,3D蛋白主要定位于细胞核;Western blotting证实pEGFP-3D融合蛋白在80 kDa处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性.pEGFP-3D表达载体转染细胞后很快就能通过观察荧光蛋白而检测出基因的瞬时表达情况,为基因转染研究中确定转染效率、3D的表达情况及蛋白定位等提供了直观的靶标,有望应用于FMDV聚合酶分子的生物学特性研究.     

利用番茄果实特异启动子E8改造‘外源基因清除’的表达载体及转化金柑研究

利用"外源基因清除"技术(‘Gene-Deletor’),将外源基因从转基因金柑果实中彻底清除,可以达到用转基因作物生产出非转基因食品的目的。本研究利用引物pE8F和pE8R从樱桃番茄中克隆果实特异启动子E8,通过SalⅠ和SmaⅠ双酶切置换掉"外源基因清除"载体(pCambia-LF-polseed-FLP,简称Y-A)中的花粉、种子特异启动子PAB5,重新构造"外源基因清除"载体Y-A-E8,利用农杆菌EHA105介导转化实生态金柑,获得转化植株,并通过nptⅡ基因特异引物nptⅡ-F和nptⅡ-R PCR检测阳性转化植株。载体Y-A-E8 SalⅠ和SmaⅠ双酶切结果表明,E8启动子成功替换启动子PAB5,Y-A-E8经EHA105介导转化成功获得11株转化植株且PCR检测到6株为Y-A-E8转基因植株。研究结果可为"外源基因清除"技术在转基因金柑方面的应用提供参考。     

布鲁氏菌omp25基因真核表达载体的构建与分析

摘 要: 【目的】 构建表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌并进行验证。 【方法】 对流产布鲁氏菌疫苗株S19外膜蛋白基因omp25设计特异引物进行PCR扩增,连接到pGM-T载体上,获得pGM-T-omp25,进行PCR扩增、酶切、测序鉴定。将质粒pGM-T-omp25与pGBKT7载体进行EcoRⅠ/SalⅠ双酶切,回收DNA片段,并进行连接,构建pGBKT7-omp25后,转化酿酒酵母菌Y187,并进行PCR鉴定、自激活实验和毒性检测。 【结果】 克隆了流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25,PCR、酶切、测序表明成功构建了pGBKT7-omp25真核表达载体,获得的转化子酵母Y187菌株无自激活活性,无毒性。 【结论】 成功构建了表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌,为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定基础。关键词：流产布鲁氏菌;基因omp25;酿酒酵母Y187;真核表达     

拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定

克隆得到正确的拟南芥WUS基因,成功构建WUS基因组成型植物表达载体和WUS-EGFP融合基因诱导型植物表达载体,分别转化了根癌农杆菌EHA105,并用WUS基因组成型植物表达载体转化橡胶树愈伤组织,得到组织化学检测阳性的愈伤组织,为深入研究WUS基因生理生化功能做准备。用双酶切切下植物表达载体PBI121的35S-GUS片段,将其连接到pCAMBIA2301上成为中间植物表达载体pCAMBIA2301-35S-GUS。提取拟南芥总RNA,通过RT-PCR方法获得WUS基因,经过TA克隆连接到pEASY-T1载体上,再用双酶切切下WUS基因,将其取代pCAMBIA2301-35S-GUS中的GUS片段,形成pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体。同时以质粒pCAMBIA2301-EGFP为模板,PCR获得EGFP,用重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR）获得WUS- EGFP融合基因,经双酶切将融合基因连接到诱导型植物表达载体pER8上,构成pER8-WUS-EGFP诱导型植物表达载体。通过电击转化法将这两个载体成功转入根癌农杆菌EHA105中,经过双酶切检测、PCR检测与测序分析,检测结果皆完全正确,克隆的WUS基因与WUS-EGFP融合基因序列和NCBI上公布的序列也完全一致,说明这两个植物表达载体已经构建成功。另外用pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体遗传转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,经GUS染色为蓝色,说明愈伤组织转化成功。     

两种抗病基因双T-DNA区双元载体的构建

选择标记基因的删除是植物转基因工程中重要的步骤之一,双T-DNA区双元载体转化法以其共整合频率高、删除标记基因效率高的优点在植物遗传转化中应用非常广泛。本文通过构建天麻抗真菌蛋白基因、脂质转移蛋白基因双T-DNA区双元载体,为培育不含选择标记基因的抗病新材料奠定基础。通过PCR的方法克隆GAFP基因,产物纯化测序确定序列准确后与pSB130-35S载体进行BamHⅠ、SacⅠ双酶切;pCAMBIA2300-LTP、pSB130-35S经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后连接,连接产物转化大肠杆菌。采用基因特异性引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆,重组质粒pSB130-GAFP、pSB130-LTP双酶切产物大小分别为540bp、1200bp,与预期产物大小一致,pSB130-GAFP、pSB130-LTP双T-DNA区双元载体构建成功。载体pSB130-GAFP、pSB130-LTP转化根癌农杆菌后可以直接用于植物的遗传转化。     

甘蓝型油菜CONSTANS基因植物过表达载体构建及转基因植株的获得

甘蓝型油菜CONSTANS目的基因的克隆以NCBI上公布的序列设计全长扩增引物进行扩增。对目的基因片段测序并进行酶切位点分析,设计酶切引物(BamHⅠ,SacⅠ),通过BamHⅠ和SacⅠ双酶切将目的基因片段连接在真核表达载体pBI121上,PCR鉴定结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功构建。将过表达载体转化感受态EHA105细胞,通过拟南芥花絮侵染T0代种子,用含卡拉霉素(50 mg/L)的MS固体培养基进行筛选,获得阳性植株。通过PCR鉴定,结果表明PBI121+CONSTANS过表达载体已成功导入拟南芥中,获得转基因阳性苗12株,为下一步基因功能分析做好了准备。     

转Bt-CpTI-GNA基因棉花的研究

采用农杆菌介导法将外源三价抗虫基因(Bt-CpTI-GNA)导入常规棉花品种中,获得转基因再生株,分子检测表明外源基因已在棉花体内表达,并遗传给后代材料。PCR分子检测与转化的标记基因和外源目的基因抗性三者极有规律性。其所携带的基因在转基因棉花中有分离现象,这可能是外源基因整合到受体棉株体内“基因沉默”而引起所致。     

禽脑脊髓炎病毒VP1基因植物表达载体的构建

以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增.将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810 bp的产物.VP1基因和 pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础.     

含BADH和Bar基因的植物表达载体的构建

采用PCR技术扩增出甜菜碱醛脱氢酶基因BADH,并于上下游引物5’端分别添加Xhol和SacI酶切位点和保护性碱基序列;TA克隆PCR产物至pTA2并进行测序验证;双酶切经过测序验证的重组质粒pTA2-BADH和植物表达载体pBA002,分别回收目的基因和pBA002载体片段,并进行连接转化,提取阳性质粒,然后进行双酶切、PCR扩增和进一步的测序验证。结果表明BADH基因已被完整、正确的插入到pBA002载体中,成功构建了含BADH和Bar基因的植物表达载体,为进一步的植物遗传转化奠定了基础。     

大豆磷高效基因GmPHR1和GmPAP4共转化及新种质创制

磷对大豆生长发育至关重要,土壤有效磷缺乏严重影响其产量和品质。目前已有学者通过转基因手段将磷高效相关基因转入大豆,并获得转基因新材料,但多数集中于单基因转化,而双基因共转化研究甚少。本研究在前期获得转磷高效相关基因GmPHR1、GmPAP4大豆新材料基础上,利用农杆菌介导与常规杂交技术进行双基因共转化,结果发现,采用这2种方案均可实现双基因共转化,获得了经PCR及DNA测序分析验证正确的转GmPHR1与GmPAP4双基因新材料“JD12-PHR1-PAP4”。     

小麦LMW-GS基因的分离与归类

本研究以湖北省小麦栽培品种鄂麦18为材料,采用Glu-D3位点特异性的引物,以叶片DNA为模板,进行PCR扩增.经过PCR产物与克隆载体的连接、连接产物转化感受态E.coli DH5α、蓝白斑筛选以及菌落PCR鉴定,获得34个阳性克隆;经测序分析获得两个LMW-GS基因完整编码序列,在GenBank中的基因登记注册号为DQ822593和DQ822596,其中,DQ822593编码序列全长1 287 bp,DQ822596编码序列全长908 bp,所推导的蛋白质都含有8个半胱氨酸残基,1～19个氨基酸为前导信号肽序列,前者属于LMW-GS中的Type Ⅰ类,后者属于TypeⅡ类,目前正在鉴定这两类基因的功能.     

pVLT-EGFP载体构建及其在巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的表达研究

为了研究巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)在植物体内的定殖,利用酶切连接的方法,以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因与表达载体p VLT-33为基本元件,构建了重组表达载体p VLT-EGFP,电转巴西固氮螺菌R7细胞,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)研究了不同温度、不同时间EGFP m RNA的表达情况。酶切及测序结果表明,成功构建了p VLT-EGFP载体,并在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达;q PCR结果显示:30℃,诱导9 h EGFP基因的表达水平最高。本研究成功构建了重组表达载体p VLT-EGFP,为实现p VLT-EGFP的可控表达及研究固氮菌在植物体内的定殖规律及促生长机理提供了一种有效的途径。     

抗旱、耐盐基因P5CS植物表达双元载体的构建

以含有P5CS的重组质粒pBIP5CS—F129A为模板,通过PCR的方法获得了目的基因P5CS（1905bp）并将其克隆到pBS—T载体上。利用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ将P5CS基因从克隆载体上消化下来,定向插入到无GUS基因植物表达载体pCHF3的CaMV35S启动子和NOS终止子之间。通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定表明,P5CS基因植物表达双元载体构建成功。