O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因在哺乳细胞中的表达

为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)蛋白酶3C基因的真核表达质粒,并在BHK-21细胞中进行表达,以RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因,利用XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶将3C基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),通过脂质体法转染重组质粒pcDNA3.1(-)-3C。PCR,双酶切鉴定及测序结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C构建成功;Western-blot分析结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C在BHK-21细胞中能够表达O型FMDV蛋白酶3C基因。该真核表达质粒的构建,为进一步研究O型口蹄疫空衣壳的体外组装以及O型口蹄疫空衣壳疫苗的开发建立了实验基础。     

口蹄疫病毒3D基因真核表达载体pEGFP-3D的构建及其融合蛋白分子在BHK细胞中的定位

为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况.从重组质粒pMDl8.T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经Barn H Ⅰ/Hind Ⅲ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定.阳性质粒进行测序.利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞.免疫组化检测转染细胞中3D基凶表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达.结果表明,成功构建了重组表达质粒pEGFP-3D,并在BHK-21细胞中进行了表达.免疫组化分析表明,3D蛋白主要定位于细胞核;Western blotting证实pEGFP-3D融合蛋白在80 kDa处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性.pEGFP-3D表达载体转染细胞后很快就能通过观察荧光蛋白而检测出基因的瞬时表达情况,为基因转染研究中确定转染效率、3D的表达情况及蛋白定位等提供了直观的靶标,有望应用于FMDV聚合酶分子的生物学特性研究.     

共表达O型口蹄疫病毒P12A+3C基因的重组杆状病毒的构建

构建共表达O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C的重组杆状病毒,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础。从质粒T-OP1中扩增出编码O型FM-DV衣壳蛋白前体的P12A基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pFastDual-3C的PH启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pD-P12A3C。通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒B-P12A3C,转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒经增殖并感染Sf9细胞后,通过双抗体夹心ELISA方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表达。结果表明,表达产物能被O型FMDV阳性血清识别,具有一定的反应原性,表明重组杆状病毒构建成功,该研究为O型FMDV空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究提供了前期材料。     

H5亚型禽流感病毒HA基因在WISH细胞中的瞬时表达

在WISH细胞中,对H5亚型禽流感病毒HA基因进行了瞬时表达的研究。首先构建了真核表达质粒pVAX-H5HA,通过酶切和PCR筛选阳性克隆后测序。然后将重组表达质粒以脂质体介导法转染WISH细胞。通过RT-PCR在转录水平检测目的基因的表达,间接免疫荧光检测目的蛋白。结果表明,HA基因在WISH细胞中进行了表达。     

牛结核杆菌MPB64蛋白的真核表达

利用PCR技术扩增出牛结核杆菌mpb64基因片段,克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pCM64,将该重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验和Western blotting检测目的基因的表达情况.结果表明,在转染了重组质粒pCM64的SP2/0细胞中出现绿色荧光,转染的SP2/0细胞泳道23 kDa处出现特异条带,说明mpb64基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达.     

新西兰白兔γ-干扰素在昆虫细胞中的表达及其活性测定

用RT-PCR方法对ConA刺激后的新西兰白兔外周血淋巴细胞(PBMC)扩增家兔γ-干扰素(IFN-γ)基因并进行测序,测序结果显示,与GenBank公布的序列核苷酸同源性达到99.4%～99.6%,氨基酸同源性为98.8%～99.4%;然后通过克隆、转化将家兔γ-干扰素基因转入转移载体pFastBacTM1,得到重组转移载体pFastBacTM1-IFN-γ,用pFastBacTM1-IFN-γ转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经筛选得到重组穿梭载体Bacmid-IFN-γ,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV-Bac-IFN-γ,经RT-PCR鉴定,结果显示重组IFN-γ在Sf9昆虫细胞中得到表达。用兔IFN-γELISA试剂盒测得重组兔IFN-γ的浓度为1 950 pg/mL。细胞病变抑制法结果显示,重组兔IFN-γ在MDCK上显示了较高的抗病毒活性,并测得重组兔IFN-γ的活性约为5.12×105 U/mg。     

口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定

利用定点突变方法,构建含有预期突变的口蹄疫病毒O/HN/93株全长cDNA克隆,将全长cDNA的重组质粒线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,转染细胞盲传至第3代50 h后出现典型致细胞病变效应(CPE),第4代10 h出现典型的CPE。对收获的病毒分别用RT-PCR、分子标签测序、间接免疫荧光和电镜观察等进行鉴定,均证实成功拯救到了O/HN/93株FMDV。成功获得O/HN/93株的感染性分子克隆,为进一步研究抗原谱广、免疫原性好的候选疫苗株奠定了骨架基础。     

敖汉细毛羊BMP4基因质粒的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

旨在构建敖汉细毛羊BMP4基因的质粒及转染成纤维细胞后研究基因表达量的变化。以30日龄的敖汉细毛羊胚胎为研究对象。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中BMP4基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得BMP4基因片段、将得到的BMP4基因连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-BMP4重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pcDNA3.1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将重组pcDNA3.1-BMP4表达载体转染成纤维细胞,后检测BMP4基因在mRNA和蛋白水平上表达量的变化。结果显示:pcDNA3.1-BMP4构建成功后转染成纤维细胞BMP4基因的mRNA和蛋白表达量均显著上升,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P0.01)。成功构建了敖汉细毛羊BMP4基因的质粒,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

口蹄疫病毒AF72株 3D聚合酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用RT—PCR方法扩增口蹄疫病毒（FMDV）AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM—Teasy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a（＋）中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

A型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达

文章旨在利用原核表达系统表达并纯化出A型口蹄疫病毒VP1蛋白。首先从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP1基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP1并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PET32-VP1。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP1并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明A型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。     

犬SLAM基因真核表达载体的构建及Vero细胞系转染的研究

为了研究犬瘟热病毒细胞受体SLAM基因的特性和功能。将基因SLAM克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建真核表达载体pCDNA3.1/SLAM,重组质粒纯化后应用脂质体2000转染到Vero细胞中,通过RT-PCR和免疫印迹方法检测犬SLAM基因在Vero细胞中的转录和表达情况。结果表明：成功构建了表达SLAM基因的真核表达载体,RT-PCR和免疫印迹显示SLAM基因获得表达;pcDNA3.1/SLAM载体的构建为研究犬SLAM基因在Vero细胞中的稳定表达奠定了基础。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的克隆表达

为了研究不同时间段细胞MHC分子表达的变化情况,从分子水平上说明E2基因与NHC之间的关系,本研究克隆了中国猪瘟病毒强毒石门毒株E2基因,构建了pcDNA3.0真核表达质粒P-E2基因。限制性内切酶进行双酶切和序列分析鉴定E2基因插入位置、方向和读码框架的正确性。构建成功的真核表达质粒P-E2,用脂质体转染方法瞬时转染进行体外细胞表达,转染后24,48 h后用Western-blot和间接免疫荧光技术检测P-E2基因质粒在PK-15细胞内的表达情况。结果表明：用His抗体进行间接免疫荧光检测发现E2基因得到表达,并定位于细胞浆,同时Western-blot检测后发现重组质粒P-E2转染后也在PK-15细胞中得到了表达。为进一步研究猪瘟病毒与宿主细胞之间的关系,病毒的致病机理提供了基础材料。     

猪IgG Ⅱ类Fc受体基因真核表达重组质粒的构建及表达

利用本研究小组克隆的猪IgG Ⅱ类Fc受体cDNA(swFcγRⅡ)基因序列(DQ026064)设计引物,应用RT-PCR技术,从猪外周血白细胞cDNA中扩增了完整的960 bpswFcγRIIORF序列,利用基因重组技术将swFcγRIIORF基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3,经PCR及双酶切鉴定:扩增出901 bp的PCR产物;KpnI/EcoR I双酶切,切出5 376和901bp DNA片段,表明重组质粒pcDNA/swFcγRⅡ构建成功。然后脂质体法转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验鉴定了swFcγRII配体亲和特性。     

敖汉细毛羊Hoxa5、BMPR1B基因互作研究

旨在构建敖汉细毛羊Hoxa5、BMPR1B基因的质粒及共转染成纤维细胞后,通过基因表达量变化研究两基因的互作。以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA,参照GenBank中Hoxa5、BMPR1B基因序列信息分别设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Hoxa5、BMPR1B基因片段,将得到的Hoxa5、BMPR1B基因分别连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-Hoxa5、pEASYTM-T1-BMPR1B重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。其次,对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B共转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Hoxa5、BMPR1B基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示,经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B构建成功,并且共转染成纤维细胞BMPR1B基因的表达量明显下降,Hoxa5基因的表达量明显升高且共转染组的表达量极显著地高于单转染组(P0.01)。成功构建了敖汉细毛羊Hoxa5、BMPR1B基因的质粒,并且成功共转染成纤维细胞,Hoxa5基因的表达量明显升高,BMPR1B基因的表达量明显下降,因而Hoxa5基因抑制了BMPR1B基因的表达,BMPR1B基因促进了Hoxa5基因的表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素A基因的 克隆与原核表达

从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A（porcine mannan-binding lectin A,pMBL-A）基因。再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

藏猪IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表达

旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。     

猪瘟病毒Shimen株p80基因的克隆及其真核表达质粒的构建

根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5'端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。     

口蹄疫病毒受体羊源整联蛋白β6亚基配体结合域的原核表达、纯化及鉴定

利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域 (LBD)片段,分离纯化目的蛋白.以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pP_(RO)EX~(TM)HTb相连,构建原核表达质粒pP_(RO)/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞 BL21 (DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白.SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物.成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊FMDV受体整联蛋白亚基β6LBD在大肠杆菌中的高效表达, SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为33 kDa,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中.用本试验室保存的抗FMDV受体猪源整联蛋白β6亚基LBD的单克隆抗体进行ELISA 和Western blot检测,显示该单抗可与重组目的蛋白发生特异性反应,证明纯化后的蛋白与特异性抗体具有良好的特异性反应及抗原活性.为深入研究整联蛋白受体β6亚基在羊体内的分布及其在FMDV致病过程中的作用机制奠定了基础.