一个受黄萎病菌诱导的海岛棉功能基因GbVWR的克隆与表达

黄萎病是一种土传真菌维管束病害,严重影响棉花产量和品质。挖掘抗黄萎病相关基因对于棉花抗黄萎病遗传改良具有重要意义。本研究通过筛选黄萎病菌胁迫下的海岛棉全长cDNA文库和陆地棉SSH文库,获得一个与黄萎病菌胁迫相关的基因,命名为GbVWR。生物信息学特征和基因表达分析表明,GbVWR基因全长520 bp,开放读码框198 bp,编码65个氨基酸残基组成的蛋白,理论等电点为5.32,包含一个信号肽和一个跨膜区,是一种分泌蛋白。GbVWR基因可以诱导表达7 kD的蛋白。在GbVWR基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到真菌激发子响应、激素响应、伤口响应及黄酮生物合成基因调节等应答元件。GbVWR基因在海岛棉根中表达最高,茎中其次,叶中最低。受黄萎病菌诱导后,GbVWR基因在接菌后2 h可对黄萎病菌作出应答反应。此外SA、ET和GA均可显著诱导GbVWR基因的表达。初步推断GbVWR是海岛棉抵御黄萎病菌过程中一个新的功能基因,通过参与多种激素信号途径发挥功能     

一个棉花β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆与特征分析

利用本实验室分离的防卫基因类似物片段,通过5’和3’RACE,从海岛棉海7124中克隆了一个β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为GbGLU。其全长1 266 bp,含一个编码361个氨基酸残基的开放阅读框。该基因编码产物理论分子量和等电点为MW = 39.66 kD,pI = 9.15,含有糖基水解酶家族17的保守结构域,N端有26个氨基酸残基组成的信号肽。Southern结果显示,GbGLU在棉花基因组中以单拷贝形式存在,研究发现,GbGLU的表达受黄萎病菌的诱导。聚类分析表明,棉花葡聚糖酶基因可分为3类,分别含有糖基水解酶家族3、9、17的保守结构域。无论棉花中的还是本研究中参考的其他作物中,受病菌诱导的葡聚糖酶基因都含有糖基水解酶家族17的保守结构域,故推断其为此类基因参与抗病反应的功能域。     

棉花RAV基因家族的全基因组分析

在二倍体棉花D5基因组(Gossypium raimondii Ulb.)数据库中鉴定出10个RAV基因,分布于4、5、8、9、13号染色体;在二倍体棉花A2基因组(Gossypium arboreum L.)数据库中鉴定出10个RAV基因,与棉花D5基因组的R AV成员的数量和序列具有一一对应的同源关系,推测棉花A、D组的祖先种中可能存在10个RAV基因。对植物R AV蛋白序列做系统发育分析,将R AV成员分为4个组;发现棉花R AV基因可能参与了棉属所特有的基因组多倍化事件的证据。对N CBI中陆地棉(Gssypium hirsutum L.)EST、Unigene数据库做比对统计,得到陆地棉不同组织中R AV基因表达情况;对陆地棉受黄萎病菌胁迫后的荧光定量检测,发现棉花RAV基因与棉花响应黄萎病菌的胁迫相关。     

棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA序列。该cDNA序列长1 598 bp, 利用5′RACE技术得到上游318 bp的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp的cDNA序列, ORF为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点pI＝5.69, 分子量MW＝53.2 kD。该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。根据Southern杂交结果推测GhSAHH基因在陆地棉基因组中为单拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体, 将GhSAHH基因定位在第20号染色体上。     

茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶1号不同白化阶段的表达

高等植物叶绿素的生物合成对其正常光合作用起关键作用。本文根据前期芯片杂交结果, 采用RT-PCR和RACE技术克隆了3个茶树叶绿素合成相关基因, 分别为谷氨酸-tRNA还原酶(CsGluTR)、叶绿素合酶(CsChlS)、叶绿素酸醋氧化酶(CsCAO), 对应的GenBank的登录号为HQ660371、HQ660370、HQ660369。序列分析表明, CsGluTR基因全长2165 bp, 开放阅读框长1665 bp, 编码554个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.6 kD, 理论等电点为8.78;CsChlS基因全长1463 bp, 其中开放阅读框长1125 bp, 编码374个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为40.5 kD, 理论等电点为8.58;CsCAO基因全长2146 bp, 其中开放阅读框长1611 bp, 编码536个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.8 kD, 理论等电点为8.03。比对分析表明, 3个基因编码的氨基酸序列与其他植物中同源基因的相似性均在70%以上。利用荧光定量PCR技术检测3个基因在不同白化阶段的表达,表明, CsChlS和CsCAO基因具有明显的表达协同性, 它们在叶片中的表达量与叶片的颜色变化高度同步;而CsGluTR在白化叶片和正常叶片中的表达差异相对较小, 同时在新生芽叶转绿过程中最先恢复正常表达水平。说明在白化叶片中, 叶绿素的合成机制受到较大影响, 叶绿素合成受阻导致的叶片内色素类物质含量降低或消失是叶片白化的直接原因。     

西和半夏凝集素抗虫基因克隆及对棉花的遗传转化

采用同源序列克隆方法,通过设计特异引物克隆甘肃西和半夏(Pinellia ternata)凝集素基因pta,其序列全长l069bp,编码区804bp,编码268个氨基酸残基,有3个典型的甘露糖结合位点,预测分子量和等电点分别为29.1kD和7.77,GenBank登录号AY725425。构建了35S启动子驱动的植物表达载体pBI-pta。建立了陇棉2号花粉管通道法遗传转化技术,获得5株卡那霉素抗性和PCR检测阳性植株,为建立棉花转基因方法和培育抗虫种质奠定了基础。     

棉属D基因组3个野生棉种Bet v1基因鉴定及功能分析

【目的】对棉花D基因组中Bet v 1基因家族进行分析,比较其在不同抗性棉种间的表达模式差异,为深入研究Bet v 1基因在棉花抗黄萎病中的作用提供理论依据。【方法】通过生物信息学方法对D基因组中Bet v 1基因进行鉴定。通过雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)、三裂棉(G. trilobum,D8)和瑟伯氏棉(G.thurberi,D1)转录组和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析Bet v 1基因在黄萎病菌处理下的表达模式。利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)对Bet v 1基因进行功能鉴定。【结果】[棉花D基因组中包含59个成员,其中57个基因带有内含子,分布于8条染色体上,多数为亲水性蛋白并定位于细胞质。]黄萎病菌胁迫条件下3个野生棉种的Bet v 1基因表达量与其抗病水平一致。将不同表达水平的基因分为3组,其中第3组基因响应黄萎病菌侵染并在抗病棉种瑟伯氏棉中高表达,表明该组基因可能与黄萎病胁迫应答反应有关。从中筛选出高水平表达的Bet v 1基因,在陆地棉中沉默相应的同源基因,棉株感病加重,揭示该基因在棉花抵御黄萎病菌侵染过程中起正调控作用。【结论】响应黄萎病菌胁迫的Bet v 1基因在棉花抗黄萎病复杂的生物过程中至关重要。本研究结果为棉花Bet v 1家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析棉花Bet v 1基因的功能奠定基础。     

果子蔓凤梨Actin基因的克隆与序列分析

持家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参,以确定目标基因的相对表达量。基于前期从全长cDNA文库中获得Actin基因的EST单克隆,进行Primer Walking测序,获得一个Actin基因的全长cDNA序列,序列长1625bp,ORF为1131bp,可编码377个蛋白氨基酸,命名为Goactin1(GenBank登录号:HQ184438)。蛋白质理论分子质量为41.7kD,等电点pI为5.31,包含一个Actin superfamily保守区,二级结构主要由随机卷曲、Alpha螺旋、延伸链和Beta转角组成。此外以2BTF A链为基础建立起了Goactin1蛋白的三级结构图。系统进化树分析表明Goactin1蛋白与马铃薯、棉花、烟草、短柄草、拟南芥等的Actin蛋白聚为一类,它们的亲缘关系最近。     

陆地棉EPSPS基因的克隆及其组织特异性表达分析

 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）是莽草酸途径中的一个重要酶,它是非选择性除草剂草甘膦的靶标酶,在高等植物中定位于叶绿体质膜上。根据EST拼接的序列设计引物,从陆地棉品种珂字棉312中获得了全长为1834 bp的cDNA序列,其最大可读框为1565 bp,编码521个氨基酸。陆地棉EPSPS基因与其它植物中同类酶在氨基酸水平上有广泛的同源性。通过与已知的其它高等植物叶绿体转运肽剪切位点比对,推断棉花EPSPS基因含有74个氨基酸叶绿体运输肽和447个氨基酸组成的熟蛋白。该酶具有保守的PEP结合位点及催化位点的特征序列。半定量分析表明,该基因产物广泛存在于棉花根、茎和叶等各组织中,在叶片中表达量较高。进一步扩增棉花核基因组获得了3344 bp的DNA序列,它包含8个内含子和7个外显子。棉花EPSPS基因的克隆为抗草甘膦棉花种质资源的创制提供了理论基础。     

陆地棉(Gossypium hirsutum)光敏色素B基因(GhPHYB)克隆及其生物信息学分析

本研究依据已公布的雷蒙德氏棉基因组测序结果,采用同源克隆的方法,以陆地棉TM-1幼苗为材料,利用RT-PCR技术克隆得到陆地棉光敏色素B基因(Gh PHYB)的c DNA序列。结果显示:该基因ORF全长3 582 bp,编码1 194个氨基酸;通过与已知的拟南芥光敏色素B氨基酸序列比对及蛋白结构预测,发现该基因包含植物光敏色素完整的结构,与烟草、拟南芥、水稻、小麦和玉米的氨基酸序列相似性分别为87.2%、77.9%、74.5%、74.5%和54.6%。同时,本研究还构建了Gh PHYB基因的RNAi干涉载体用于转化棉花,并通过构建棉花PHYB RNAi突变体了解陆地棉PHYB基因对棉花株型、开花期、产量、棉纤维品质、抗逆性等方面的调控作用。研究结果可为该基因今后应用于棉花生产奠定基础。     

Molecular Cloning and Characterization of the Actin-depolymerizing Factor Gene in Gossypium barbadense

Sea Island cotton (Gossypium barbadense L.) has been highly valued in Verticillium wilt resistance and many fiber qualities including fiber length,strength,and fineness.To identify whether it had some special genes in fiber development in comparison with the upland cotton (G.hirsutum L.),an actin-depolymerizing factor (ADF) gene was cloned and characterized in this research.A 420 bp open reading frame of the cloned gene,termed GbADF1,encoded a protein of 139 amino acids,which included39.57% nonpolar amino acids,17.27% acidic amino acids,15.83% basic amino acids,and 31.92% hydrophobic amino aids.     

棉花抗黄萎病相关基因的序列和表达分析

黄萎病是棉花生产的主要病害,克隆抗病基因是培育棉花抗黄萎病品种的关键。本文根据前期的定位结果,结合棉花基因组测序信息,提取定位区段内基因组序列,预测获得63个基因。Gene Ontology分析表明63个基因参加多种生物进程,其中6个基因参与植物抗逆进程。根据Gene Ontology分析和前人研究结果,选择15个基因进行序列分析。启动子序列分析表明启动子区域包含各种抗逆的调控元件,其中6个基因包含了W-box元件。对海7124和苏棉8号棉花幼苗进行黄萎病菌处理,取病菌处理后不同时期的根,选择14个基因进行表达分析,结果表明在黄萎病菌处理后,有8个基因表达出现变化,其中在海7124和苏棉8号之间表达差异最大的基因是跨膜蛋白(Transmembrane protein 214-a isoform 1)、细胞色素P450(Cytochrome p450)和Udp-糖基转移酶UGT89A2(Udp-glycosyl transferase 89a2-like)基因。本研究为抗病基因克隆提供了候选基因。     

棉花冠菌素不敏感因子GhCOI1基因分离和对大丽轮枝菌的抗性分析

为了解决黄萎病对棉花的危害,利用基因工程技术培育抗病棉花品种是当前育种的主要目标。从棉花中克隆了一个黄萎病抗性基因GhCOI1,其编码冠菌素不敏感因子。GhCOI1基因序列全长2 213 bp,编码一个600氨基酸的多肽,分子量为68 k Da,等电点p I是7.06。GhCOI1含有典型的F-box和LRR结构域。组织表达分析表明,该基因在根器官优势表达,并且其表达受到大丽轮枝菌浸染诱导。利用病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术,抑制了GhCOI1基因在棉花植株中的表达;通过大丽轮枝菌接菌分析表明,GhCOI1基因沉默能够引起植株的抗性下降,发病加重。研究结果表明GhCOI1参与棉花对大丽轮枝菌抗性调控,因此,其可以作为棉花抗病育种的候选基因。     

不同抗性品种对棉花黄萎病菌致病力的影响

 以1个海岛棉品种和15个陆地棉品种为分离寄主,采取单孢分离,共分离出67个黄萎病菌系。以抗性差异较大的海岛棉品种Pima90-53和陆地棉品种冀棉20、邯208和中棉所8号为鉴别寄主,采用苗期营养钵定量注菌液法对分离菌系进行了致病力鉴定。结果表明,同一地块田间不同品种所分离菌系的致病力类型并非单一类型,而是由致病力连续变化的多种致病力菌系类型组成;由不同品种分离出的菌系致病力存在差异,寄主品种的抗性与分离的黄萎病菌系的致病力无关,但不同基因型品种可能会影响不同致病力菌落的消长。     

利用染色体片段代换系定位棉花抗黄萎病QTL

通过陆地棉与海岛棉杂交并与陆地棉回交,获得1个染色体片段代换系苏VR043,抗江苏非落叶型黄萎病菌系BP2。分子检测表明,苏VR043兼有陆地棉苏棉8号的遗传背景和海7124的D4染色体片段。以苏VR043和苏棉8号为亲本构建包含176个单株的F2群体,通过标记分析和F2:3家系抗病鉴定,发现抗病性状与标记NAU3392连锁,p值为2.3×10-12。根据棉花D组染色体测序结果,参照置换区段的基因组序列,合成92对SSR引物;PCR扩增分析发现,有5对引物在苏棉8号和苏VR043之间表现多态性,并将抗病主效QTL定位在标记ZHX32和NAU3392之间,标记间遗传距离为3.2 c M,QTL解释表型变异64.8%。同时参照棉花D组测序结果,提取对应的置换区段序列,预测包含63个基因,基因聚类分析表明7个基因参与抗逆反应,其中1个基因与抗病相关。     

陆地棉抗黄萎病种质创新与抗病基因挖掘

抗病种质在抗病育种中的地位不可替代。远缘杂交材料创新是陆地棉黄萎病抗性种质创制的重要基础;基因工程提供了创造变异的新技术,但由于抗病机制复杂,导入一、两个主基因的效果还不明显;采用分子生物学技术揭示棉花对黄萎病的抗性机制,发掘棉花抗病基因和病程相关基因,有助于剖析棉花-黄萎病菌互作机制。本文概述了陆地棉抗黄萎病种质创制、抗病品种选育的成就,介绍了棉花黄萎病抗性机理与功能基因发掘等方面的最新进展,为抗病分子设计育种提供理论支持。