锦鲤疱疹病毒ORFl基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus Virus,KHV）诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORFl基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌E．coliBL21（DE3）后诱导表达,再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS．PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37．3KD,为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1：27000。表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

毕赤酵母表达的猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白及其免疫原性分析

为了获得具有良好免疫活性的基因工程抗原蛋白,利用毕赤酵母真核表达系统,表达猪传染性胃肠炎(河北分离株)的纤突糖蛋白。根据Gen Bank TGEV S基因设计一对引物,经PCR扩增出长2.2 kb的目的基因S,将S基因亚克隆于p PIC9k载体,转化TOP10感受态,PCR、酶切鉴定阳性克隆,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,然后电转GS115感受态,利用G418抗性进行多拷贝整合子初步筛选,提取基因组并做PCR鉴定,得到阳性菌株,经诱导发酵后,上清发酵液经SDS-PAGE电泳检测,显示获得分子量为82 kDa左右的目的蛋白,同时用Western-Blotting检测到一条特异的目的条带;用目的蛋白免疫小鼠,ELISA检测免疫S蛋白小鼠血清抗体效价为1∶100,表达蛋白具有免疫活性。     

绵羊FecB基因的原核表达及其抗体制备

为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。     

流产衣原体CPAF基因的克隆序列分析及原核表达

为了研究流产衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的免疫原性,建立快速有效的流产衣原体抗体检测方法,根据Gen Bank中公布的流产衣原体基因组序列,设计并合成了流产衣原体CPAF蛋白编码基因的特异性引物,以流产衣原体标准菌株基因组为模板,经PCR扩增获得长度为1 809 bp目的基因片段;对获得的目的基因进行测序,并用生物信息学软件进行预测分析;再将该片段插入原核表达载体p ET-30a中,经双酶切、测序鉴定;构建成功的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG对目的蛋白进行诱导表达,通过对诱导条件的优化,确定诱导表达的最佳条件,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot检测。结果显示,成功克隆流产衣原体CPAF蛋白的编码基因,该编码产物可能是定位于宿主细胞质中的一种衣原体分泌性蛋白酶,分子内具有多个可能的抗原表位;重组表达质粒经IPTG诱导后,表达分子质量为67.6 ku的CPAF蛋白,该重组蛋白能与抗His-tag单克隆抗体以及流产衣原体阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。结果表明,以大肠杆菌表达系统重组表达的流产衣原体CPAF蛋白具有良好的免疫原性,可作为动物流产衣原体病的血清学诊断及亚单位疫苗研究的候选抗原。     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪源Viperin基因的克隆、原核表达以及抗体的制备

为研究猪Viperin蛋白在猪体内的抗病毒活性,用IFN-α刺激PK-15细胞24 h,收集细胞提取RNA后,采用RT-PCR方法扩增猪Viperin基因,并连接至p EASY-blunt simple平末端连接测序载体,PCR鉴定后送公司测序正确。采用DNAStar分析猪Viperin蛋白的免疫原性和疏水性,选取抗原性较好的一段基因,采用PCR扩增后,插入pET-28a+大肠杆菌表达载体,在37℃条件下用IPTG诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析证明,Viperin重组蛋白以包涵体的形式表达,包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗式佐剂进行乳化后颈背部皮下注射9日龄的BALB/c小鼠,14 d后加强免疫一次,收集小鼠血清。采用Western Blot、IFA鉴定制备多克隆抗体的特异性,该多克隆抗体可以和阳性sViperin真核表达载体pCI-sVIP等表达的猪源Viperin蛋白进行特异性反应。试验成功克隆了猪Viperin基因,并制备了良好Viperin蛋白的多克隆抗体。     

猪Fc受体γ亚单位基因克隆与原核表达

应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。成功克隆出猪Fc受体γ亚单位基因并表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。     

重组人肿瘤坏死因子TNF-α的克隆与原核表达

为了构建人肿瘤坏死因子TNF-α与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合基因表达载体,并进行原核表达。以人肿瘤坏死因子TNF-α全长转录本为模板,设计特异性引物,经PCR扩增目的基因将其定向克隆到pMD-l8T simple vector中,构建重组质粒pMD-18T-TNFα。然后通过亚克隆将测序正确的TNF-α基因插入表达载体pGEX-4T-1中,筛选出阳性质粒转化宿主菌株BL21(DE3),通过温度、时间等不同条件诱导表达重组蛋白。结果表明,成功克隆到大小为702 bp的TNF-α全长cDNA序列,通过限制性酶切、PCR扩增证实pMD-18T-TNFα和pGEX-4T-1-TNFα载体已构建成功。诱导表达得到约51 kDa重组蛋白GST-TNFα。说明重组蛋白GST-TNFα的表达成功,为进一步获得纯化TNF-α,研究其生物功能、作用机理,制备抗TNF-α单克隆抗体奠定基础。     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒（CSFV） C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

A型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达

文章旨在利用原核表达系统表达并纯化出A型口蹄疫病毒VP1蛋白。首先从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP1基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP1并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PET32-VP1。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP1并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明A型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。     

中介蝮蛇毒纤溶酶基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了从中介蝮蛇毒腺中提取总RNA,研究其具有重要药用价值的纤溶酶,从基因工程的角度进行研究开发蛇毒资源。通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到FLE基因,再亚克隆到pPROEXHTb原核表达载体上,构建重组表达载体;将阳性重组表达载体转化到大肠杆菌中诱导表达,采用SDS-PAGE检测该重组蛋白的分子量。结果表明：成功的构建了重组原核表达载体ppPROEXHTb-FLE,并在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白分子量约为30 KDa。说明可以采用该方法进行中介蝮蛇毒纤溶酶的原核表达,该研究为进行蛇毒纤溶酶的开发奠定了分子基础。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72 kDa。Western blotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。     

牛IL-6基因原核表达及其对口蹄疫病亚单位疫苗的佐剂效应研究

为了研究荷斯坦奶牛白介素6(IL-6)基因作为佐剂对VP1蛋白免疫效果的影响,分别克隆IL-6基因和VP1基因,连接到载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-6P-1/BoIL-6、pGEX-6P-1/VP1、pGEX- 6P-1/BoIL-6/VP1。重组质粒在大肠杆菌RS21中高效表达,动物试验检测IL-6作为分子佐剂对豚鼠免疫应答的影响。结果表明：构建的重组质粒在原核系统中正确表达,以包涵体形式存在。表达的融合蛋白三次免疫豚鼠后,检测发现IL-6/VP1组能够诱导产生高水平的体液免疫反应和细胞免疫反应,与疫苗组及VP1+FCS组免疫效果相当。本实验证实IL-6作为分子佐剂能够提高VP1的免疫效果。     

兔出血症病毒的鉴定及其系统发育分析

为确定临床家兔的死亡病因并对其病原进行研究分析,本试验通过临床症状、剖检变化和RT-PCR技术以及HA-HI试验对一起家兔的慢性死亡进行了诊断。结果表明：为兔出血症病毒感染引起的兔瘟。然后设计引物对该病毒的唯一结构蛋白VP60衣壳蛋白的全基因序列进行了RT-PCR扩增、测序和比对分析。结果显示：引起本次家兔死亡的兔出血症病毒的VP60长度与其他已知毒株一致,也是由1740个碱基组成,与已发表毒株的VP60的同源性达90%以上;在系统进化上与俄罗斯2009年的一个流行毒株同源性最高(98.1%)。本试验研究结果表明本次引起非典型兔瘟的兔出血症病毒仍然具有较高的保守性,但病毒的结构蛋白也发生了一些小的变异,这些变异成为基因亚群划分的依据。     

小反刍兽疫病毒核蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了获得小反刍兽疫病毒特异性抗原N蛋白,用于检测血清中抗小反刍兽疫病毒抗体的检测方法的建立,本文根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白核苷酸序列,设计引物,扩增N基因。扩增片段通过NdeI和NotI酶切位点插入表达载体pCold I。重组蛋白通过pCold I载体转化,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了原核表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,表达产物为58kDa的融合蛋白,可被PPRV感染动物血清识别,重组蛋白具有良好的反应原性。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立了检测PPRV血清的间接ELISA方法,与国外标准ELISA试剂盒的符合率达98.3,为建立快速检测小反刍兽疫病毒抗体检测方法奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

藏猪IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表达

旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。     

马氏珠母贝TLR2基因cDNA的分子特征及组织表达分析

TLR2（toll like receptor 2）是TLR模式识别受体家族的重要成员之一,参与有机体的免疫识别。本研究采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得了马氏珠母贝（Pinctada martensii）TLR2基因（PmTLR2）cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时检测了PmTLR2基因的mRNA在马氏珠母贝六个组织中的表达。结果表明：PmTLR2基因的cDNA全长2614 bp,包含41 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR,27 bp的polyA,开放阅读框为2274 bp,编码758个氨基酸残基。多序列比对显示PmTLR2与牡蛎TLR2的序列相似性最高,为51%;Smart软件分析显示PmTLR2的蛋白序列中含有8个亮氨酸重复序列（Leucine rich repeats,LRRs）, 1个C端亮氨酸富集区（Leucine-rich repeat C-terminal,LRR-CT）,1个N端亮氨酸富集区（Leucine-rich repeat N-terminal,LRR-NT）,1个TIR（Toll/IL-1R）同源结构域（TIR）;荧光定量PCR分析表明PmTLR2在马氏珠母贝肝胰脏、性腺、血淋巴、鳃、外套膜和闭壳肌六个组织中均有表达,鳃中表达量最高。本研究为进一步阐述PmTLR2在马氏珠母贝免疫应答中的作用机制提供理论基础。