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【目的】在大肠杆菌中表达猪白细胞介素-2(pIL2),并鉴定其生物学活性。【方法】以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增IL-2基因。将猪IL-2基因定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-pIL2,并应用甲基噻唑基四唑(MTT)试验测定融合蛋白的生物学活性。【结果】以含有猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增出1条约420bp的带。所获重组质粒pGEX-pIL2经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。SDS-PAGE电泳结果显示,可检测到相对分子质量约为42ku的GST-pIL2,Western-blot证实GST-pIL2能与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应。表达蛋白经薄层层析扫描分析,表达量约占菌体总蛋白的40%。MTT试验证实,表达产物经变性、复性后能极显著促进猪脾淋巴细胞增殖。【结论】猪IL-2基因在大肠杆菌中得到表达,表达的蛋白具有一定的生物学活性。 相似文献
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为了确定河南部分地区按照正常免疫程序接种猪伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失苗的猪场是否发生了PRV野毒感染,了解新流行株的主要毒力基因g E是否发生变异,利用PCR方法,对南阳、周口、巩义、济源、漯河、原阳等地采集的疑似PRV感染的病料进行检测。对PCR检测为阳性的病料接种猪睾丸细胞,传至6代,分离出9株PRV,克隆其g E全基因并进行序列分析。结果表明,9株PRV均能扩增出1 862 bp的g E基因,且彼此之间同源性为99.9%~100%,与其他PRV毒株同源性为97.5%~99.6%。9株分离株处于一大分支上,且均含有2个氨基酸插入,在448位和510位均发生氨基酸置换。结果表明,分离株均为PRV野毒株,且g E基因有不同程度的变化,与河南省伪狂犬病的重新流行有密切联系。 相似文献
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猪IL-2基因的克隆、序列分析及其杆状病毒表达载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列设计1对引物,将猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆到pGEM-TEasy载体上并测序.测序结果显示,克隆的猪IL-2 cDNA全长为516 bp,开放阅读框(ORF)包含465 bp,编码154个氨基酸,相对分子质量为17 400,等电点为5.27,此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%.与猫、牛、鸡、犬、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%、82.6%、28.2%、80.6%、29.6%、83.4%、81.3%、82.0%和61.5%.将此IL-2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual后获得了重组质粒pFBD-IL2,进而转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到了含猪IL-2基因的重组DNA,将其命名为Bacmid-IL2.本试验为进一步在昆虫细胞中表达猪IL-2基因、开发研制新型免疫佐剂奠定了基础. 相似文献
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以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增猪IL-2成熟蛋白基因。将猪IL-2成熟蛋白基因定向克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual中,转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2,转染昆虫细胞。间接免疫荧光试验表明重组猪IL-2在Sf9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到相对分子质量为20000的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,重组猪IL-2经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,重组猪IL-2在昆虫细胞中得到表达,表达的重组蛋白具有一定生物学活性,为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank发表的鸭α-干扰素(interferon-alpha,IFN-α)基因序列(AY879230),设计并合成了1对引物,提取固始鸭和樱桃谷鸭基因组DNA,应用PCR技术扩增地方品种固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,并克隆、测序.测序结果表明获得了固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,大小均为584 bp,包含1个IFN-α基因完整的开放阅读框,编码191个氨基酸的多肽.推导的氨基酸有2个潜在的 N-糖基化位点,有7个与二硫键形成有关的半胱氨酸.克隆的固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与北京鸭IFN-α基因的氨基酸序列比较,仅固始鸭IFN-α基因发生突变D38N.固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与其他IFN-α基因的氨基酸序列遗传进化树分析表明樱桃谷鸭与北京鸭有很近的亲缘关系,固始鸭次之.地方品种固始鸭在非常保守的38位发生了氨基酸突变,推测这可能与该品种鸭具有很强的抗病能力有关. 相似文献
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根据GenBank已经公布的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE全基因序列,设计合成了1对引物,利用PCR技术对猪伪狂犬病河南原阳病毒株相关的毒力基因gE进行了扩增,将特异性DNA条带进行回收,回收的PCR产物克隆到pMD?18-T载体中,并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。运用蓝白斑筛选,挑取阳性菌落,提取重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。测序结果表明,该序列全长为1 862 bp,将该基因核苷酸序列与从GenBank下载读取的马来西亚株(FJ176390)、爱尔兰Nia-1株(FJ605136)、湖北Ea株、韩国株(AY249861)、美国Becker株(AY368490)、广东SH株(EF55242 7)、西班牙株(EU502923)、河南焦作株(EU561349)等的gE基因进行同源性分析比较,得出的核苷酸同源性分别为99.4%、97.9%、99.7%、99.6%、98.0%、99.7%、97.8%、99.0%。通过对其序列进行的测定,有利于进一步从分子水平研究PRV在某些地区的流行、变异规律,也为PRV的诊断和预防奠定了基础。 相似文献
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