猪嵴病毒CH441株VP1基因的克隆与序列分析

为了深入研究嵴病毒(sw Ko V)主要结构蛋白基因VP1,根据Gen Bank中已发表的猪嵴病基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒CH441株VP1基因,并对其进行克隆与测序分析。结果表明,sw Ko V CH441株的VP1基因为762 bp,与Gen Bank已发表的嵴病毒属的15株嵴病毒序列的VP1基因相比较,sw Ko V CH441株的VP1基因与其他各毒株VP1基因的核苷酸同源性为81.5%~90.2%,氨基酸同源性为86.6%~96.9%,进化分析显示,sw Ko V CH441株与GS-1株之间的亲缘关系较近。生物信息学分析显示,VP1蛋白理论等电点(p I)为4.40,理论分子质量为26.978 2 k Da;其序列上共发现18个磷酸化位点,分别为Ser(7)、Thr(6)和Tyr(5),而蛋白的磷酸化与信号转导有关,预测该蛋白为一重要的信号转导分子;无信号肽和跨膜区。为进一步开展sw Ko V CH441株VP1基因在遗传变异等方面的研究奠定了理论基础。     

兔出血症病毒VP60基因的表达及其免疫原性研究

为研究兔出血症病毒VP60基因原核表达蛋白的免疫原性。采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后进行序列测定,将测序正确的纯化产物经双酶切,克隆入原核表达载体PET28b中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E. coli RosettaTM中,用IPTG诱导培养重组表达菌。结果表明：经SDS-PAGE分析,在相对分子量62.0 KD处可见明显的表达带,经Western blot鉴定,在62.0 KD处出现明显的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。说明RHDVVP60基因原核表达蛋白具有较好的免疫原性。     

携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究

为了研究RHDV病毒样粒子作为载体提呈外源B细胞表位的能力,以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,构建携带FMDV B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa)的VP60嵌合蛋白,研究外源基因对VP60蛋白的表达、病毒样颗粒(VLPs)的装配及免疫原性的影响。分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入外源B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa),得到嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,分别命名为VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。经IFA、SDS-PAGE和Western Blot方法鉴定嵌合蛋白的表达,通过电镜观察嵌合蛋白自聚为病毒样颗粒的能力,通过动物试验研究其免疫原性。结果显示,嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,可自聚形成病毒样颗粒,免疫小鼠后可以产生针对VP60和B细胞表位特异的免疫应答。该研究为嵌合VP60 VLPs的形成及结构功能的研究奠定基础,同时为RHDV-VLPs作为外源B细胞表位展示载体的可行性提供依据。     

猪嵴病毒福建株结构蛋白VP 基因的克隆与生物信息学分析

为丰富猪嵴病毒结构的分子流行病学数据,明确福建株猪嵴病毒结构蛋白VP的特征,研究运用RT-PCR方法设计特异性引物,对猪嵴病毒结构蛋白进行分段扩增后进行克隆测序,并将测序结果进行拼接后进行生物信息学分析。结果表明,所扩增福建株猪嵴病毒含有完整的结构蛋白VP,其基因全长为2529 bp,编码有843个氨基酸,理论等电点为5.34,理论分子质量为89.603 kD,不稳定系数为37.71,最大疏水指数为2.522,最小疏水指数为-2.622。其和XX株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最高,仅为86.7%,与swine/S-1-HUN/2007/Hungary株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最低,为83.7%。从遗传进化上看,猪嵴病毒结构蛋白在遗传进化上呈现2个独立的分支,中国猪嵴病毒分离株在2个遗传分支上均有分布。     

鸡新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

研究旨在从分子生物学角度研究新城疫病原F基因,探究NDV F基因的遗传变异情况及其蛋白结构。提取新城疫病毒基因组RNA,根据GenBank中已知的NDV La Sota株序列设计引物扩增F基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒pMD-NDV-F进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒F基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、蛋白结构跨膜区分析及F蛋白三级结构的预测。核苷酸序列测定结果表明：F基因为1792 bp,共编码553个氨基酸;生物信息学分析结果表明：F基因在种属间具有较高的保守性,试验获得的F基因与NDV La Sota、Clone30、V4、B1等弱毒株的一致性较高,具有典型的弱毒株特性,F基因的氨基酸序列与新城疫病毒La Sota株F基因的序列同源性最高可达100%;F蛋白的三级结构预测结果显示：F蛋白部分片段与新城疫病毒F蛋白融合片段的相似性为96%。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

兔病毒性出血症的诊断要点与综合防治

<正>兔病毒性出血症俗称兔瘟,是由兔病毒性出血症病毒引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病。1989年世界动物卫生组织将该病正式列为B类传染病,我国将其列为二类传染病。一、诊断要点1.家兔中,长毛兔最易感染,2月龄以上的青年兔和成年兔也易感染,40日龄以下仔兔和部分老龄兔不易感染。该病一年四季均有发生,春、秋季发病率相对较高,北方地区一般发生于冬春寒冷季节,夏季少见。在新疫区或未接种疫苗的兔场一旦发病,死亡率极高。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72 kDa。Western blotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。     

鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株全基因组的克隆与分子系统进化树分析

为了获得鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株的全基因组cDNA,确定其分子进化关系。以IBDV J1C7株细胞培养液为材料,用蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取IBDV基因组dsRNA,利用特异性引物将基因组A、B节段分两段进行RT-PCR并通过融合PCR方法将具有部分重叠序列的A、B节段的上、下游基因组进行拼接,从而构建出完整的A、B节段基因组,利用pMD-18T载体快速克隆PCR产物。结果表明：获得了3260 bp的A节段全长（Genbank登录号EF646854）和2827 bp的B节段全长（Genbank登录号EF646853）。氨基酸同源性比对结果表明：J1C7株与弱毒疫苗株CEF94（芬兰）、P2（德国）、JD1（中国）、HZ2（中国）的亲缘关系最近（蛋白同源性为VP5：99.3%;VP2：99.3%~100%;VP4：97.9%~99.2%;VP3：96.4%~98.1%;VP1：99.2%~99.9%）。BDV J1C7株属于弱毒疫苗株,且与欧洲和中国的弱毒疫苗株有密切的亲缘关系,在进化树上归为一簇。本研究为构建IBDV的感染性cDNA,了解IBDV基因组的结构与功能打下了基础。     

3株鸭肝炎病毒1型全基因序列分析

为分析3株1型鸭肝炎病毒(DHV)的遗传变异和进化关系;采用RT-PCR和5'-/3'-RACE.方法测定3株1型鸭肝炎病毒全基因序列;研究结果表明,不含poly(A)尾巴的3株病毒的基因组全长为7691~7700nt,基因组均仅含一个长度为6750nt的ORF,625~627nt5'端非翻译区和325~328nt3'端非翻译区(UTR)。将3株病毒株与GeneBank公布的其他DHV-1全基因序列及小RNA病毒科的其他属代表病毒株进行序列分析表明,聚蛋白均被分割成为12个蛋白,其中VP1的变异性最大,180~187位为高变区。3株病毒与DHV-1参考毒株核苷酸序列同源性在93.7%~98.8%,氨基酸序列同源性在96.9%~98.8%,DHV-1各株在小RNA科病毒多聚蛋白氨基酸序列进化树上形成一个独立的进化分支;DHVs-1病毒间核苷酸和氨基酸仍较保守,它们在进化中可将其归为小RNA病毒科的一个新属。     

2009年山东H9N2亚型禽流感M基因的分子进化分析及对哺乳动物致病性的研究

根据GenBank公布的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)M基因序列设计引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增H9N2亚型禽流感病毒M基因,并与GenBank中AIV M基因序列进行了同源性比较和氨基酸编码分析,绘制了M基因的系统发育进化树。结果表明：这6株病毒的M基因的核苷酸同源性在95.9-99.4%。M1蛋白的同源性在97.6-99.6%。M2蛋白的同源性在95.1-100%。进化分析这6株病毒都属于A/Quail/Hong- Kong/G1/97 (G1)-like 分支。这6株病毒的M2蛋白的第31位氨基酸存在S→N（AGT→AAT）的变异,都具有金刚烷胺的抗性。以106 EID50 的剂量,将H9N2 病毒鼻腔感染BALB/c 小鼠,结果表明H9N2 亚型流感病毒可以对哺乳动物小鼠可使得体重下降,也可致死。.本研究结果对于揭示H9N2 亚型禽流感流行规律和病毒的致病机理具有一定的意义。     

锦鲤疱疹病毒ORF1基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus Virus,KHV)诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORF1基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后诱导表达。再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774 bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS-PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37.3 KD为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1:27000,表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

南方水稻黑条矮缩病毒S9片段基因编码产物的生物信息学分析

预测南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV) S9片段编码蛋白的功能,为进一步深入分析相关基因编码产物的功能提供理论依据。应用RT-PCR克隆了SRBSDV云南芒市分离物(SRBSDV-YNMShi)的S9片段,测定其全序列,并对S9及其编码蛋白进行生物信息学分析。结果表明,S9片段全长1900 nt,编码P9-1和P9-2 2个蛋白。S9核苷酸序列与广东、海南、湖北分离物的同源性分别为99.5%、99.1%和98.7%。系统进化分析再次印证了SRBSDV是斐济病毒属的成员,SRBSDV-YNMShi与广东、越南分离物聚成一枝,与海南分离物有一定的进化分离趋势。P9-1为一个不稳定疏水蛋白,亚细胞定位于细胞核内,无规则卷曲是该蛋白质的主要结构元件,与其亲缘关系最近的水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)有着类似结构。P9-2是有2个跨膜结构域的亲水性稳定蛋白,亚细胞定位于质膜,α-螺旋是其主要结构元件,有1个保守的G蛋白偶联受体。P9-1可能为SRBSDV复制的关键因子,P9-2可能为膜蛋白,具有转运的功能。     

红花檵木CHS基因的克隆与序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第1个关键酶。根据植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物,以红花檵木(Loropetalurn chinense var. rubrum)大叶红的嫩叶为材料,用RT-PCR方法,分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cDNA（GenBank登录号为JQ609678）,将该基因命名为LcvrCHS1。该序列长927 bp,编码232个氨基酸残基。其核苷酸序列与GenBank已登录的同样来源的核桃、山茶属植物CHS序列同源性达83%,与其他科植物（绣球花、葡萄、桃、马铃薯、甘草、领春木属）CHS序列同源性也达到80%以上;其编码的氨基酸序列与山茶属、葡萄、鳄梨、洋梨、沙梨、映山红CHS基因编码的氨基酸序列同样具有高度同源性,同源性高达98%。     

口蹄疫A型病毒AF/72株标准细胞毒株的研制

用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠继续适应3代后,转适BHK-21细胞,获得该毒株的细胞毒AF/72/MF6/BF12,经测定其TCID50为10-8.0/mL;经RT-PCR获得其VPI基因序列,并与GenBank中的其他6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性均大于85%;经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng/mL,远大于22 ng/mL的国际标准.综合纯净性检验结果、特异性检验结果和146S含量,确定AF/72/MF6/BF12为口蹄疫A型病毒株AF/72的标准细胞毒.     

水貂肠道酵母菌的分离鉴定及系统发育分析

了获得水貂专用的有益菌种,以为研究毛皮动物益生菌制剂提供理论基础。从健康水貂的肠道中分离纯化出2株酵母菌,编号为JM1和JM2,进行了形态学观察、生理生化试验以及26S rDNA基因序列分析,并构建了系统发育进化树,同时对其生长情况和安全性等进行了综合鉴定。传统鉴定方法和26SrDNA D1/D2区序列分析结果表明：JM1为弗比恩毕赤酵母,菌株JM2为酿酒酵母;生长情况结果表明：2菌株在14~30 h生长较快,在30~40 h生长趋于平稳;2菌株培养液中糖度12 h时波美度开始急速下降,并且在26 h后有升高趋势;安全性试验显示：2菌株对小鼠均无毒性,且在2.73×107cfu/mL时小鼠生长速度最快。     

一株生防细菌的分离鉴定及其抑菌活性物质的分析

随着人们对农产品品质和安全性要求的提高,高效生物防治资源的筛选显得尤其重要。本研究通过平板对峙实验、分子鉴定、刚果红染色、葡聚糖酶基因克隆与序列分析等方法获得一株抑制多种植物病原真菌的芽孢杆菌,编号为YW26。16S rDNA基因序列分析表明该菌株为解淀粉芽孢杆菌;刚果红染色显示该菌株具有很强的产纤维素酶能力;根据GenBank数据库中芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因(CP000560)序列设计引物,克隆得到1527 bp的片段,经测序、BLAST分析显示该片段与Bacillus amyloliquefaciens FZB42内切β-1,4-葡聚糖酶基因序列同源性为99%。该解淀粉芽孢杆菌抑菌效果显著,具有较强产纤维素酶能力。因此,该菌株可作为一种生防资源,开发新的生防制剂。     

口蹄疫OA／58病毒株VP2蛋白结构模拟与B细胞抗原表位的分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pMD18-T载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和BamH I,Hind III双酶切法鉴定。运用同源模建得到OA/58 VP2蛋白三维空间结构,并结合理化性质、亲水性、可塑性和免疫原性进行分析,找出OA/58 VP2蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,OA/58 VP2蛋白存在多个潜在的抗原表位,可能的蛋白质抗原表位区域:1~23,40~63,71~78,82~91,102~106,113~119,131~138,148~154,166~177,189~196,212~218。应用同源模建得到的OA/58 VP2蛋白三维空间结构来预测其B细胞表位,为进一步研究OA/58 VP2蛋白在引起易感宿主体液免疫应答方面提供了一种可视化的技术平台,并且为选择表达其他口蹄疫病毒株的VP2蛋白分子提供有参考价值的信息。     

桑花叶型萎缩病病原的检测与序列分析

旨在获得安康地区桑花叶萎缩病病原序列,为桑花叶萎缩病的防治提供更多的信息。用RT-PCR技术对安康地区染花叶型萎缩病病株的病原进行了分离,克隆测序并在Mfold网站预测其二级结构。该病的病原为桑花叶萎缩类病毒MMDVd-201110151（GenBank登录号：JQ809700）,核苷酸长度357 bp,GC含量50.7%,219 bp后38个碱基与樱桃小圆形类病毒样核糖核酸具有约85%的一致性。Mfold网站预测二级结构有58.3%的碱基配对,两端为分枝状结构。成功分离到安康地区桑花叶型萎缩病病原。     

鸭IGF-IR基因部分序列克隆、鉴定及在胚胎期胸肌组织中的差异表达分析

为了克隆分析鸭IGF-IR基因部分的cDNA序列,并研究该基因的组织表达规律。通过同源性比对,克隆了IGF-IR基因cDNA部分片段,并运用生物信息学方法分析了不同物种序列进化关系,运用荧光绝对定量PCR技术检测了IGF-IR mRNA在肉用型品种高邮鸭和蛋用型品种金定鸭胚胎期不同发育时期胸肌中的表达。序列分析结果表明：克隆得到的鸭IGF-IR基因cDNA270 bp片段长度,其核苷酸序列与鸡、人、小鼠、大鼠、猪、牛的IGF-IR基因相应核苷酸序列的同源性分别为95%、79%、78%、77%、78%、76%;荧光绝对定量结果表明：IGF-IR基因在胸肌中呈“波浪形”表达,在21胚龄表达量最高,与17、25、27胚龄和7日龄差异显著(P<0.05);IGF-IR基因在品种间表达量除21胚龄时差异显著外(P<0.05),其余各胚龄差异均不显著(P>0.05),表明IGF-IR mRNA的表达在所研究品种胚胎期的胸肌中相对稳定。