农杆菌介导茎尖转化体系对不同基因型棉花转化率的影响

选用两种不同基因型陆地棉华抗6号和06S62为材料,以无菌黄化苗茎尖为受体,用农杆菌介导法进行转化,对不同的菌液浓度、浸染时间和负压处理等进行了比较试验,探讨农杆菌介导对两种不同基因型棉花遗传转化率的影响。结果表明,农杆菌介导棉花转化的适宜条件是：对于华抗6号,菌液浓度OD600达到0.7、浸染时间10min、负压处理10min时,转化的效果较好;对于06S62,菌液浓度OD600达到0.9、浸染时间15min、负压处理15min时,转化的效果较好,华抗6号的转化率高于06S62,其最高转化率为8.81%。通过该茎尖遗传转化体系,将bar导入上述两个基因型棉花获得了抗除草剂的转基因植株。     

农杆菌介导的地黄遗传转化体系的优化

旨在通过对农杆菌介导的地黄遗传转化体系影响因子的研究,探索最佳转化条件,为建立高效地黄遗传转化体系奠定基础。利用正交实验,通过检测地黄叶片中gus基因瞬时表达情况,对地黄遗传转化效率的决定因子进行了系统研究。正交试验表明,地黄遗传转化过程对转化效率影响程度从高到低的因素依次为：共培养时间、预培养时间、菌液浓度和侵染时间;以地黄叶片为外植体,材料不经过预培养,菌液OD600值为0.6,侵染时间5 min,并在培养基中添加100 μM乙酰丁香酮,共培养3天条件下可达最高转化效率,gus基因瞬时表达率可达65.63%。通过对根癌农杆菌介导的地黄遗传转化体系的优化,建立了高效的瞬时表达转化体系。     

影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件的研究

利用小麦成熟胚愈伤组织的高效再生体系,对影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件:预培养时间、共培养时间、抗生素(Kan)筛选压、头抱霉素浓度、菌液浓度和侵染时间等进行了研究。最后确立的转化条件为:预培养时间为1～2d,共培养时间为3d,Kan筛选压为100mg/L,头孢霉素所用浓度500mg/L,当菌液浓度OD600=0.6浸染45min。并对得到的再生植株进行了PCR检测,初步证实了目的基因转到了小麦基因组中。     

农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

以东北春玉米自交系7922、340、78599、921及美国杂交种H99等幼胚愈伤组织为受体,利用农杆菌介导法转化Bt(CryIA.)基因,研究菌液预处理、愈伤组织状态、侵染培养基、侵染时间及共培养条件等因素对转化频率的影响。根据转化愈伤组织的除草剂(Basta)抗性筛选结果评估转化率,表明继代培养3￣5d的愈伤组织适于转化,其中以继代5d的7922愈伤组织转化率最高,为46.6%;不同基因型对农杆菌转化率存在差异,H99的抗性愈伤组织率为34.57%,7922为26.27%、340为21.36%、78599和921抗性愈伤组织率仅为8.02%和6.78%。基因型间差异显著;浸染培养基中加入(AS100￣200mg/L)抗性愈伤转化率明显提高;菌液浓度OD6000.5￣0.6、侵染时间5￣10min、共培养时间3d最佳。     

农杆菌介导HaBADH基因转化马铃薯的研究

本研究以马铃薯(Solanum tuberosum L.)试管薯作为转化受体,利用农杆菌介导法将从梭梭中获得的甜菜碱醛脱氢酶基因(HaBADH)转化马铃薯,采用正交试验设计优化了影响马铃薯转化的4个主要因子,建立了农杆菌介导的马铃薯高效转化体系,获得了转基因植株。研究结果表明,转化过程中,浸染时间15 min,菌液浓度OD600为1.0,筛选培养时卡那霉素浓度30 mg/L、品种为大西洋为最佳转化方案,抗性芽分化率最高达到了35.9%;4个因子中基因型对转化效率影响最大,菌液浓度的影响次之,卡那霉素浓度和浸染时间的影响最小。经PCR、RT-PCR及Southern blot检测,证明了HaBADH基因整合到马铃薯中,阳性转化率为45.3%。     

根癌农杆菌介导的磨盘柿遗传转化体系的优化

以磨盘柿叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了ACC合成酶基因(ACS)遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对基因转化的影响。结果表明:适宜的预培养时间为2 d;用OD600值为1.0的菌液侵染15 min、共培养3 d,AS浓度200μmol/L有利于提高转化频率。经PCR分子检测,初步确定ACC合成酶基因已转入磨盘柿组培苗中。     

农杆菌介导的梭梭BADH基因转化玉米的研究

探究影响玉米遗传转化效率的因素,对玉米遗传转化系统的建立与完善有重要意义。以‘宁玉0905’为材料,经农杆菌介导将梭梭的BADH基因转入玉米基因组。结果表明：在黑暗条件下,加入乙酰丁香酮(AS),玉米遗传转化效率提高;当菌液浓度OD₆₀₀=0.3,浸染时间为5 min时,玉米的转化效率最高;农杆菌和愈伤组织共培养2天,玉米的遗传转化效果最好。对转化苗进行PCR检测得出BADH基因已整合到玉米基因组中。当菌液的OD₆₀₀=0.3,浸染时间为5 min,农杆菌和愈伤组织共培养2天时,玉米的转化效率最高。     

农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化体系优化研究

以甘肃主栽品种的茎段为外植体,研究了不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对转化效率的影响,以及选择压和培养基对抗性出芽的影响,初步建立了马铃薯品种“陇薯3号”和“台湾红皮”的遗传转化体系并获得了转化植株。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果表明,再生的转化植株假阳性率比较高,要获得预期的转基因植株群体需加大遗传转化工作中转基因植株的数量。     

农杆菌介导的番茄Micro-Tom遗传转化体系的建立

Micro-Tom番茄植株矮小,生长密度高,生命周期短,转化效率高,成为功能基因组学研究的新型模式植物。对影响Micro-Tom遗传转化频率的共培养时间、AS的添加、工程菌液浓度和抑制农杆菌所用抗生素种类进行了分析,建立了Micro-Tom稳定高效的遗传转化体系。以bar基因设计引物对转化群体进行PCR检测,阳性率为72.3%,平均插入位点数为1.8个。遗传体系的建立为Micro-Tom在植物生物学研究中提供理论基础。     

用in planta方法转化甘蓝型油菜

用in planta方法进行遗传转化极大地促进了模式植物拟南芥的功能基因组研究,但在农作物中仍少有in planta的成功报道。我们采用in planta方法,用含有质粒pSG529、pHTT613和ApSCO的农杆菌菌株转化中油821、湘油13、宁RS-1、S2501-1、华双3号等甘蓝型油菜品种。在适宜的条件下,将根癌农杆菌菌液浸染甘蓝型油菜花序10 d至15 d     

农杆菌介导高粱遗传转化的相关因素优化

为建立一个稳定的高粱遗传转化体系,以高粱RHMC品种为试验材料,采用内含有P ^CAMBIA3301质粒载体的根癌农杆菌EHA105介导的方法研究了高粱遗传转化的相关因素。结果表明,外植体预培养2d,GUS表达效果最好;在侵染液和共培养基中加入200μmol/L乙酰丁香酮时,GUS表达效果最好;侵染液浓度OD₆₀₀值的适宜范围为0.8~1.0;农杆菌侵染愈伤组织的适宜时间为5~10min;共培养的适宜时间为2d。初步建立了一套高粱遗传转化体系,为今后高粱转化提供一些参考。     

棉花农杆菌介导转化体系中影响抗性愈伤组织诱导率的因素

 以冀无2031为材料,采用正交设计方法,研究了农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化过程中菌液浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度对抗性愈伤转化效率的影响。结果表明,4个因素均对抗性愈伤的诱导率有极显著影响,其诱导效应依次是共培养温度>菌液OD值>侵染时间>共培养时间。按照正交设计的原则,最终得到农杆菌介导转化棉花下胚轴的最佳条件是：菌液OD值为0.3,侵染15 min,24 ℃共培养24 h,下胚轴抗性愈伤的转化效率最高。用珂312、中521和农大94-7对所选出的最佳组合进行了进一步验证,结果3个品种在优选组合下的抗性愈伤组织诱导率都很高,分别为93.85%、86.72%和85.83%。     

农杆菌介导的sbe2a基因RNAi载体对玉米遗传转化的研究

将淀粉分支酶基因sbe2a的RNAi表达载体转入玉米自交系H99和丹598胚性愈伤组织。探讨了不同菌浓度、不同侵染时间和不同的共培养时间对玉米转化率的影响,确定了最佳转化条件:菌液浓度OD600值为0.5～0.7,侵染时间为25min,共体培养时间为3d。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,获得了2株阳性植株,初步证明外源基因已经整合到玉米的基因组中。     

农杆菌法转化茎尖获得转SNC1基因棉花及其T_1植株对棉花枯萎病的抗性

以陆地棉中35和军棉1号的茎尖为外植体,利用农杆菌介导法将含有拟南芥抗病基因SNC1(sup-pressor of npr1-1,constitutive 1)转入棉花。对外植体培养时期、农杆菌侵染时间和共培养时间进行改良,实验结果表明,在外植体培养1d,菌液侵染20min,并且共培养保持在2d能够获得较高的遗传转化效率。PCR以及RT-PCR对再生植株T0代和T1代棉花的检测结果表明,SNC1基因已经整合到棉花的基因组中并得到表达。利用浸根法,对T1代转基因棉花接种棉花枯萎病菌强致病力菌株(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum),与对照比较,T1代转基因棉花的枯萎病抗性明显提高。     

拟青山海关杨高效遗传转化系统的建立

本实验以叶片为外植体,建立了拟青山海关杨的高频再生系统;在此基础上,利用GUS瞬时表达法研究了菌种、预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间和乙酰丁香酮（AS）浓度5个因素对拟青山海关杨叶片遗传转化的影响。结果表明,拟青山海关杨叶片最适不定芽诱导培养基为MS添加0.5mg/L的6-BA 和0.1mg/L的NAA,叶片再生频率为95%,平均不定芽数为10.07个;该杨树的高效遗传转化体系为：叶片省去预培养,菌种使用GV3101,侵染液OD600为 0.4～0.6,侵染10min,共培养培养基中添加乙酰丁香酮 200μmol/L,在此条件下,GUS荧光定量分析结果显示叶片的GUS活性达到最大值。     

毛白杨无性系叶面积的回归测算

利用快速、精准的方法,建立了4个不同毛白杨无性系的叶面积与其叶长、叶宽、以及叶长×叶宽之间的线性回归和幂函数回归方程。结果表明：1）毛白杨不同的无性系叶形指数差异较大,不同无性系的回归方程也不一样,应针对无性系计算叶面积;2）叶片生长的不同阶段叶面积的回归方程不同,因此应针对叶片的不同生长阶段确定回归方程。3）一元线性回归方程中,叶面积和叶长、叶宽的乘积的相关性最好,但只适用于功能叶片的测量;而幂函数回归方程无叶片大小限制,叶面积和叶宽的相关性较好并且测量方便,毛白杨无性系50号叶面积和叶宽幂函数回归方程为LA=1.0014×W1.8295,83号回归方程为LA=0.863×W1.832,30号回归方程为LA=0.554×W2.051,B331号回归方程为LA=1.639×W1.600。因此在今后的生产实践中,可通过测定4个毛白杨无性系的叶宽,利用其幂函数回归方程,估算叶面积。     

西瓜‘SM1’高效遗传转化体系的构建

为构建高效的西瓜再生和遗传转化体系,本研究以西瓜‘SM1’材料子叶节为外植体,研究不同激素配比对子叶节再生的影响。在此基础上,通过农杆菌介导法导入外源基因,研究潮霉素浓度、农杆菌侵染时间、共培养时间等因素对遗传转化效率的影响,建立遗传转化体系。结果表明,‘SM1’不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L,不定芽分化率为91.7%。最优遗传转化组合为农杆菌侵染时间15 min,共培养3 d,之后进行选择培养。外植体不定芽分化潮霉素最适浓度为10 mg/L,最适生根培养基为1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L。通过潮霉素筛选和PCR鉴定,获得12株阳性转化株系,转化率为6.5%。本研究建立了高效西瓜‘SM1’再生及遗传转化体系,为进一步开展基因功能研究及西瓜遗传改良提供了技术支撑。     

农杆菌介导的抗菌肽基因SPCEMA对马铃薯的遗传转化

(1西南大学园艺园林学院,重庆 400716;2西南大学农业部蚕桑学重点实验室,重庆 400716)     

重组人表皮生长因子基因遗传转化烟草研究

将携带内质网滞留信号肽SEKDEL编码序列的重组人表皮生长因子基因（hEGF）克隆到植物表达载体中构建植物表达载体pSH-hEGFS,通过冻融法将pSH-hEGFS转化到根癌农杆菌LBA4404中,以烟草无菌苗叶盘为外植体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,经抗生素抗性筛选获得抗性植株,通过GUS组织化学染色分析、PCR检测以及RT-PCR分析,证明重组人表皮生长因子基因已整合到烟草基因组中并已表达,间接法ELISA检测结果表明转基因烟草中重组人表皮生长因子表达量最高达叶片总可溶蛋白的0.003%。