农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化

本研究以普通小麦品种扬麦15和Alondra's的幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测gus基因的瞬时表达情况,研究了农杆菌介导的主要影响因子的转化效率。研究结果表明,在相同条件下两个品种农杆菌侵染的最佳条件不尽相同。扬麦15的最佳优化条件为:先在不添加AS的培养基中预培养,然后在菌液浓度为OD600=0.2、AS浓度为100μmol/L条件下侵染10min,最后在25℃共培养1d;Alondra's则在菌液浓度为OD600=0.5、共培养时间为2d时,表现出最佳的gus基因瞬时表达率。为小麦的遗传转化提供参考。     

正交设计优化根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系

采用GUS基因瞬时表达检测的方法,利用正交试验法对玉米根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的菌液OD值、侵染时间、AS浓度、共培养时间4个因素在3个水平上进行优化试验。通过对试验结果进行直观分析,方差分析和因素内多重比较分析,得到了稳定的转化体系,即菌液OD值0.6,侵染时间30min,AS浓度200μmol/L,共培养时间2d。采用优化后的玉米转化体系进行试验,通过PCR验证,得到了转基因植株,初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究

为了提高玉米自交系的遗传转化率,建立农杆菌介导玉米遗传转化体系。通过农杆菌菌株EHA105侵染玉米自交系7922的胚性愈伤组织,以β-葡萄糖苷酶基因(GUS)为报告基因研究几种因素对遗传转化体系的影响。结果表明：（1）当农杆菌浓度OD600=0.6时,GUS瞬时表达率最高为35.3%;（2）当侵染时间为15 min时,GUS瞬时表达率最高为37.3%;（3）当共培养时间为3天和恢复培养时间为4天时,GUS瞬时表达率最高为29.1%。因此选择农杆菌浓度OD600=0.6,侵染时间15 min,共培养3天和恢复培养4天,为最佳遗传转化条件。通过优化影响遗传转化体系的因素,初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

根癌农杆菌介导的磨盘柿遗传转化体系的优化

以磨盘柿叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了ACC合成酶基因(ACS)遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对基因转化的影响。结果表明:适宜的预培养时间为2 d;用OD600值为1.0的菌液侵染15 min、共培养3 d,AS浓度200μmol/L有利于提高转化频率。经PCR分子检测,初步确定ACC合成酶基因已转入磨盘柿组培苗中。     

影响农杆菌介导甜瓜子叶遗传转化的因素

以甜瓜子叶作为根癌农杆菌介导转化的受体,通过GUS基因瞬时表达率的分析,研究此转化体系的最佳实验参数.实验结果表明,预培养时间、预培养后对外植体进行处理、感染时间、共培养时间、农杆菌工程菌的浓度等对转化效率都有一定的影响,但是根癌农杆菌诱导物AS并不能大幅度提高转化效果.对外植体进行重新处理,预培养2 d,用OD560为0.3的农杆菌工程菌感染15～25 min,共培养3～4 d的理想条件下,GUS瞬时表达率可达85%.     

农杆菌介导小麦成熟胚体系的优化

针对转基因小麦成熟胚转化体系转化效率低,从提高成熟胚愈伤组织质量入手,调节小麦的基因型、成熟胚的培养时间、菌液浓度、侵染时间以及愈伤组织大小几个因素,提高成熟胚转化体系的转化效率;通过农杆菌介导,将目的基因转入到受体小麦成熟胚诱导的愈伤中,利用gus检测的方法检验转化效率;继代360d、自然生长5mm大小的受体小麦品种扬麦10,在菌液浓度OD600为0.8,侵染40min下,gus基因表达率达50%左右,接近幼胚的gus基因表达率。通过对体系的几个因素的调节,提高了农杆菌介导成熟胚转化体系的效率。     

农杆菌介导的高羊茅遗传转化体系的优化

以高羊茅品种猎狗5号的胚性愈伤组织作为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,探讨预培养培养基、预培养时间、菌液浓度、感染时间、乙酰丁香酮浓度、共培养条件等不同因素对农杆菌介导转化的影响,结果表明,高羊茅品种猎狗5号遗传转化优化条件为胚性愈伤组织先在预培养培养基(MS 6-BA0．5mg／L NAA0．5mg／L)预培养5d;然后用农杆菌菌液(OD600=0．5),感染时间10-20min,在23-25℃的温度下,共培养基(MS 蔗糖30g／L 葡萄糖10g／L CA0．5g／L Glu0．5g／L 2,4-D1．5mg／L AS 150μmol／L agar 8g／L,pH5．2～5．6)上共培养3d。在共培养基中添加AS 150μmol／L有助于提高gus基因瞬时表达率。     

多聚半乳糖醛酸酶反义基因转化加工番茄

利用农杆菌EHA105介导转化,将PG基因转入加工番茄B04植株。通过对影响外植体转化的因素（预培养时间、侵染时间、农杆菌浓度、共培养时间）进行了深入探讨,建立了加工番茄品种B04子叶外植体的高频遗传转化体系,并通过农杆菌介导法将PG反义基因导入加工番茄品种B04,获得PG抗性植株。其最佳预培养时间为2天;当农杆菌的菌液浓度为OD₆₀₀＝0.6、侵染时间为10 min时转化率最高;其最佳的共培养时间为2天。对获得的41株抗卡那霉素转基因植株进行PCR检测,其中9株为阳性植株,其转化率为22%。初步证实了部分加工番茄B04植株中已导入PG反义基因。     

棉花农杆菌介导转化体系中影响抗性愈伤组织诱导率的因素

 以冀无2031为材料,采用正交设计方法,研究了农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化过程中菌液浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度对抗性愈伤转化效率的影响。结果表明,4个因素均对抗性愈伤的诱导率有极显著影响,其诱导效应依次是共培养温度>菌液OD值>侵染时间>共培养时间。按照正交设计的原则,最终得到农杆菌介导转化棉花下胚轴的最佳条件是：菌液OD值为0.3,侵染15 min,24 ℃共培养24 h,下胚轴抗性愈伤的转化效率最高。用珂312、中521和农大94-7对所选出的最佳组合进行了进一步验证,结果3个品种在优选组合下的抗性愈伤组织诱导率都很高,分别为93.85%、86.72%和85.83%。     

农杆菌敏感小麦基因型筛选与转化条件的优化

以13个基因型小麦的幼胚愈伤和新春9号幼胚为受体材料,利用农杆菌菌株C58C1(含有GUS外源基因)进行侵染,通过组织化学染色的方法统计GUS基因瞬时表达率,以筛选对农杆菌敏感的小麦基因型及适宜的菌液浓度和侵染时间,优化农杆菌转化的条件,为逐步建立小麦农杆菌的转化体系奠定基础.结果显示,不同基因型小麦GUS瞬时表达率在0～95.9％之间,其中新春9号、小偃328和济麦19的GUS基因瞬时表达率均在90％以上;对新鲜幼胚和预培养7d的幼胚愈伤组织分别侵染30 min和60 min,前者GUS阳性率均为0,后者分别为92.0％和95.9％,说明预培养可以显著提高受体材料对农杆菌的敏感性,提高转化效率;在不同菌液浓度(OD600=0.5、1.0、1.5)侵染时,GUS基因瞬时表达率分别为93.4％、94.0％和87.6％,不同侵染时间(15,30,60 min)下,GUS基因瞬时表达率分别为94.6％、92.0％和95.9％.综合考虑认为,适宜的小麦农杆菌转化条件为幼胚经过4～7 d预培养,在菌液浓度OD600=1.0时进行15 min的侵染.     

农杆菌介导玉米愈伤遗传转化研究

以玉米自交系R18-599和齐319幼胚诱导的胚性愈伤为转化受体,对农杆菌浸染并共培养3 d后对GUS基因的瞬时表达率进行检测,优化遗传转化体系。结果表明:愈伤组织的生长状态对转化效率有很大影响,以愈伤组织继代两次、预培养7 d左右为浸染的最佳时期;另外,EHA105菌株对玉米自交系齐319愈伤的浸染效果要好于对R18-599,其平均GUS瞬时表达率分别为31.20%和23.74%,经t测验达显著水平(t<0.05)。     

农杆菌介导法将LFY基因导入嘎拉苹果的研究

以嘎拉苹果叶片为外植体,利用GUS瞬时表达率,对农杆菌介导法转化苹果的因素进行优化.结果表明:卡那霉素(Km)选择压在30 mg/L时,外植体预培养2～3 d后以OD600=0.3～0.5农杆菌菌液浸泡3～5 min,共培养3 d,延迟筛选3 d可明显提高M2叶片转化效率,GUS阳性率达50%.PCR检测初步证明,LFY基因已整合到苹果再生植株中.     

农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

以东北春玉米自交系7922、340、78599、921及美国杂交种H99等幼胚愈伤组织为受体,利用农杆菌介导法转化Bt(CryIA.)基因,研究菌液预处理、愈伤组织状态、侵染培养基、侵染时间及共培养条件等因素对转化频率的影响。根据转化愈伤组织的除草剂(Basta)抗性筛选结果评估转化率,表明继代培养3￣5d的愈伤组织适于转化,其中以继代5d的7922愈伤组织转化率最高,为46.6%;不同基因型对农杆菌转化率存在差异,H99的抗性愈伤组织率为34.57%,7922为26.27%、340为21.36%、78599和921抗性愈伤组织率仅为8.02%和6.78%。基因型间差异显著;浸染培养基中加入(AS100￣200mg/L)抗性愈伤转化率明显提高;菌液浓度OD6000.5￣0.6、侵染时间5￣10min、共培养时间3d最佳。     

根癌农杆菌介导的巴西橡胶树胚性悬浮细胞的遗传转化

为了建立橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系,用根癌农杆菌EHA105（携带pCAMBIA1301,含有gusA和hpt Ⅱ）侵染胚性悬浮细胞团,用GUS检测的方法分析了共培养时间和菌液浓度对转化效率的影响;同时,测定了胚性细胞团对潮霉素敏感性。结果表明适宜的共培养时间为3天,适宜的菌液浓度为OD600=0.4~0.6。潮霉素的致死剂量为15 mg/L。使用大约1 g鲜重的胚性细胞团,经过转化和选择培养,获得53块抗性愈伤组织,经诱导获得7个体细胞胚。GUS检测和PCR鉴定证实了gusA基因已经整合到橡胶树基因组中。本研究为根癌农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系建立奠定了基础。     

拟青山海关杨高效遗传转化系统的建立

本实验以叶片为外植体,建立了拟青山海关杨的高频再生系统;在此基础上,利用GUS瞬时表达法研究了菌种、预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间和乙酰丁香酮（AS）浓度5个因素对拟青山海关杨叶片遗传转化的影响。结果表明,拟青山海关杨叶片最适不定芽诱导培养基为MS添加0.5mg/L的6-BA 和0.1mg/L的NAA,叶片再生频率为95%,平均不定芽数为10.07个;该杨树的高效遗传转化体系为：叶片省去预培养,菌种使用GV3101,侵染液OD600为 0.4～0.6,侵染10min,共培养培养基中添加乙酰丁香酮 200μmol/L,在此条件下,GUS荧光定量分析结果显示叶片的GUS活性达到最大值。     

适用于4种玉米基因型的农杆菌转化方法的探讨

利用改良的农杆菌培养液、侵染液、共培养培养基和筛选培养基等技术体系,对4个玉米基因型Hi-Ⅱ、H99、国内2个优良自交系R18-599和齐319的新鲜幼胚、预培养幼胚、胚性愈伤组织进行了农杆菌转化研究,并比较了不同共培养方式对农杆菌侵染不同玉米组织的影响。结果表明,Hi-Ⅱ新鲜幼胚在固体培养基上共培养和滤纸上共培养后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和4.4%,前法优于后法;Hi-Ⅱ新鲜幼胚、预培养3 d的幼胚愈伤组织经农杆菌侵染后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和12.1%,新鲜幼胚比预培养的幼胚愈伤组织更适合于农杆菌转化。用上述优化的条件对另外3个不同基因型的2种不同外植体H99、齐319(新鲜幼胚)和R18-599（胚性愈伤组织）进行遗传转化,共培养3 d后的GUS基因瞬间表达率分别为65.2%、52.6%和58%,表明该转化体系适合于上述4种基因型的幼胚和胚性愈伤组织的遗传转化。此外农杆菌侵染Hi-Ⅱ新鲜幼胚后经在含巴龙霉素25~100 mg L^-1培养基上3轮选择后,抗性愈伤组织获得率为2.4%,近似反映了本研究的遗传转化率。其他3个基因型的抗性愈伤也正在筛选中。结果初步表明,本研究建立的农杆菌介导的玉米遗传转化体系可能对4种基因型均适用。     

根癌农杆菌介导马齿苋遗传转化体系的研究

利用马齿苋的叶片诱导出愈伤组织,再以愈伤组织为受体建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。利用该转化体系得到抗性愈伤组织后,对其进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定,证实为转化子,表明根癌农杆菌介导外源基因转化马齿苋的愈伤组织是完全可行的,为以后通过基因工程手段进行马齿苋的改良奠定了基础。     

小麦茎生长点转化研究初报

为了躲避转基因技术对组织培养的过分依赖,本研究以小麦为材料尝试了一种对生长点直接进行转化的方法,并初步证明了这一方法的可行性。具体做法是：将种子萌芽,然后剥去胚芽鞘暴露出生长点,再用玻璃纤维制作的小刷子将生长点刺伤,最后用带有外源基因的农杆菌进行侵染处理。用携带hph-GUS基因的LBA4404农杆菌,侵染处理1～11日龄幼苗(生长点),共培养7d后检测新生芽中GUS的瞬时表达情况;侵染1～2日龄幼苗(生长点),取长成植株的2～3朵小花进行GUS稳定表达检测。又用携带BADH和npt Ⅱ基因的AGL1农杆菌菌株侵染1日龄的幼苗(生长点),在含：100mg／L卡那霉素的蛭石中进行选择。结果表明,GUS的瞬时表达率随被处理幼苗的日龄增加而降低,以2日龄幼苗为最高(10．7％)。用花序检测GUS的稳定表达,被侵染受体为1日龄幼苗时的表达率高于2日龄的幼苗。蔗糖的存在并不提高GUS基因在花序中表达的频率。不过花序表现为GUS阳性的植株后代,经PCR检测后并没有证实GUS基因存在。用AGL1菌株进行转化,获得了13．6％的抗卡那霉素的绿色植株,但只有3株呈现PCR阳性,且只有1株结了实。     

农杆菌介导的黄瓜开花整合子CFL基因转化仙客来

以农杆菌介导法将黄瓜开花整合子CFL基因分别对仙客来幼嫩叶片、叶柄及愈伤组织进行遗传转化,比较了三种转化受体的遗传转化效率.应用超声波辅助的农杆菌介导法,对以叶片为转化受体的仙客来遗传转化体系进行了优化.结果表明:幼嫩叶片是最佳的转化受体,再生植株GUS阳性率达27.25％.叶片在农杆菌浸染时辅以60 s的超声波处理,...