棉花4个GL2同源基因的序列比较及表达分析

拟南芥GLABRA2(AtGL2)在决定拟南芥叶毛和根毛细胞的分化中起重要作用。通过同源序列查询从棉花的EST库中找到4个与AtGL2高度同源的全长编码序列(GhHOX1、GhHOX2、GhHOX3和GhHOX4)。序列分析表明4个棉花HOX基因与AtGL2基因Homeobox结构域相同氨基酸分别达到95%、71%、72%和63%。实时RT-PCR分析结果显示, GhHOX1、GhHOX3和GhHOX4均在伸长期的纤维中优势表达; 而GhHOX3在开花当天野生型胚珠中的表达量明显高于无绒无絮突变体。说明棉花GL2同源基因在棉花纤维的起始和伸长中具有重要的调控作用。     

棉花赤霉素不敏感矮化GID1同源基因的克隆和表达分析

作为赤霉素(GA)受体,GID1是其重要的信号传导组分。为研究GA在棉花发育(特别是纤维发育)中的作用,本文在EST序列的基础上克隆了6个棉花GID1同源基因(GhGID1-1~6)。多重序列分析表明,棉花GID1同源蛋白GhGID1-1~6与拟南芥和水稻的GID1蛋白高度同源,具有多个与GA和DELLA蛋白的结合位点以及激素敏感酯酶家族保守域HGG和GXSXG。定量RT-PCR分析表明,GhGID1-1~6基因在棉花不同器官和组织中表达水平有差异,其中GhGID1-1和GhGID1-2在花器官中高表达,GhGID1-4基因在纤维和根中优势表达。胚珠体外培养基中外加GA使GID1同源基因表达水平发生变化,GhGID1-1和GhGID1-2基因的表达水平明显受GA抑制。比较发现,在胚珠和纤维中优势表达的GID1同源基因不同,GID1基因表达水平随发育时期变化的趋势也不相同,表明棉花胚珠和纤维具有相对独立的GA信号识别系统。     

三个陆地棉水孔蛋白基因的克隆与表达分析

从陆地棉SSH-cDNA文库的测序结果中得到一条具有完整ORF的陆地棉水孔蛋白基因序列,将其命名为GhAQP2。以该基因编码的氨基酸序列为探针,在棉花EST数据库经同源搜索得到2个相似性较高的EST,利用RACE技术获得其全长cDNA序列,将其基因命名为GhAQP3和GhAQP4。基因结构分析发现GhAQP2和GhAQP3各有4个外显子,3个内含子;GhAQP4有3个外显子,2个内含子。生物信息分析表明3个基因编码蛋白均含有6个跨膜区,2个NPA结构域,其氨基酸序列具备MIP超家族典型的蛋白保守区序列特征。多序列比对发现3个基因的氨基酸序列与其他物种PIP2类水孔蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。qRT-PCR分析表明,GhAQP2在纤维伸长后期优势表达,GhAQP3在下胚轴和子叶中高表达,GhAQP4在纤维伸长前期优势表达,推测3个基因在不同的组织中发挥作用。GhAQP2在20DPA优势表达,为研究该基因在纤维伸长向次生壁加厚期转化过程中的表达调控提供了重要信息。     

棉花中两个新的F-box蛋白基因的克隆与表达分析

 以棉花EST序列分析为基础,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花中克隆了2个新的F box蛋白基因,分别命名为GhFB1 (GenBank核酸数据库登录号：EF419428)和GhFB2 (GenBank登录号：EF503623)。GhFB1cDNA全长866bp,编码162个氨基酸;GhFB2 cDNA全长657bp,编码161个氨基酸,而且两者均含有植物F-box蛋白家族特有的F-box结构域。序列比较分析表明,GhFB1和GhFB2蛋白与水稻OsGID2,拟南芥AtSLY1具有高同源性,是棉花中F-box蛋白家族的新成员。RT-PCR结果表明,GhFB1和GhFB2在根、下胚轴、叶、茎、花和纤维中都有表达,而且均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达,推测这2个基因在棉纤维早期发育中可能起重要作用。     

陆地棉Ghkinesin13亚家族基因的克隆及表达特征分析

Kinesin家族是一类马达蛋白,它们能利用ATP水解所释放的能量驱动自身携带物质分子沿着微管运动,在细胞形成、细胞伸长等方面起着关键作用。本研究以拟南芥Atkinesin-13A蛋白序列作为探针序列,利用Blast比对从二倍体雷蒙德氏棉的基因组数据库中发现7个具有较高同源关系的基因。根据基因序列设计引物,利用RT-PCR技术从陆地棉纤维中分离出7个基因。依据7个基因与Atkinesin-13A和Atkinesin-13B的同源性高低,依次将其命名为Gh KIS13A1、Gh KIS13A2、Gh KIS13A3、Gh KIS13B1、Gh KIS13B2、Gh KIS13B3和Gh KIS13B4。生物信息学分析表明,7个Ghkinesin13均含有典型的KISC马达区域、ATP结合位点和微管结合位点,其马达区域属于中央马达。多重序列比对和进化树分析发现,这7个蛋白可被分为2个(Kinesin13A和Kinesin13B)亚类。实时荧光定量PCR结果表明,7个Ghkinesin13亚家族基因在棉花各组织中均有表达,但表达模式各不相同,其中Gh KIS13B4在纤维中优势表达,表明其在纤维发育过程中可能发挥着重要作用。     

陆地棉GhLEA3基因的克隆及其响应低温胁迫表达分析

【目的】本研究旨在探索棉花GhLEA3基因的结构特征及其在低温胁迫下的表达模式,研究其抗逆功能。【方法】利用同源序列克隆法在陆地棉中克隆GhLEA3;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质,构建系统进化树。采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白表达载体35S∷GhLEA3-GFP并进行亚细胞定位;在棉花三叶期进行叶片低温表达分析;采用农杆菌介导的花序浸染法将GhLEA3基因转入拟南芥;对T_3转基因拟南芥种子进行4℃低温萌发试验;低温处理后测转基因拟南芥叶片的电导率。【结果】GhLEA3基因编码序列全长1 218bp,编码405个氨基酸;GhLEA3蛋白含有4个功能结构域PF02987。陆地棉GhLEA3与拟南芥AtLEA3氨基酸序列之间相似性为52.6%。GhLEA3蛋白可能定位在液泡和小泡中。GhLEA3基因在低温处理的棉花叶片中上调表达。T_3转基因拟南芥低温萌发率显著高于野生型,低温处理后转基因拟南芥叶片电导率显著低于野生型。【结论】陆地棉GhLEA3属于典型的LEA3家族成员,与拟南芥AtLEA3亲缘关系最近;该基因响应低温胁迫,可能在抗冷中起重要作用。     

一个棉花液泡转化酶基因的克隆与功能分析

棉纤维正常发育需要大量的蔗糖供应。转化酶是生物体内蔗糖代谢途径中的关键酶之一, 对转化酶基因的结构和功能研究将有助于揭示复杂的棉纤维发育分子机制, 并为纤维品质改良提供优良的基因资源。本研究以棉纤维突变体im和遗传标准系TM-1纤维发育中显著差异表达的EST序列(GenBank登录号为EY196825)为探针, 通过电子克隆方法, 结合cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆到一个棉花液泡转化酶基因GhVacInv2a (GenBank登录号为KF305322)。该基因ORF全长1857 bp, 编码618个氨基酸, 与已登录的陆地棉GhVacInv2基因(GenBank登录号为FJ864677)序列一致性为99%(E=0)。基因组序列分析表明, GhVacInv2a在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含1个拷贝, 在四倍体陆地棉和海岛棉中存在2个拷贝, 其中GhVacInv2a和GhVacInv2分属于A、D亚组同源基因。该同源基因含7个外显子, 6个内含子。Q-PCR分析表明, 该基因在花药中表达量最高, 在快速伸长的纤维组织中优势表达。在13~19 DPA的纤维中, 其在TM-1中的表达水平极显著地高于im突变体。开发SNP标记, 将GhVacInv2a基因定位在异源四倍体棉花第3染色体上。标记与性状的关联分析显示, GhVacInv2a与纤维强度存在显著相关(P=0.0087), 表明GhVacInv2a在棉花纤维品质形成中可能发挥重要功能。     

陆地棉两个同源基因GhBlind的克隆与表达分析

Blind同源基因对植物株型调控起着重要作用。本研究用同源克隆策略,在陆地棉(Gossypium hirsutum L.) 腋芽部位cDNA中克隆出2个Blind同源基因GhBlind1(GenBank登录号为HQ115643)和GhBlind2(登录号为HQ115644)。GhBlind1和GhBlind2由3个外显子和2个内含子组成,分别编码359个和262个氨基酸残基。组织特异性表达分析表明, GhBlind1在腋芽部位和茎尖分生组织部位优势表达,在根、叶、茎尖、幼嫩纤维表达,而在茎部不表达;GhBlind2在腋芽部位以及根、茎、叶片、茎尖表达,而在纤维不表达。通过重组PCR技术,构建表达载体Psuper-gus-b1和Psuper-gus-b2;应用根癌农杆菌EHA105介导转化棉花胚性愈伤组织进行瞬时表达分析。将棉花胚性愈伤组织共培养4 d后,2个表达载体转化的胚性愈伤组织中均能检测到GUS活性,但Psuper-gus-b2表达活性强于Psuper-gus-b1。对Blind同源蛋白的保守结构域比对发现,GhBlind1和GhBlind2与Blind同源蛋白的一致性分别达94%和91%。以Blind同源蛋白作为外参,结合NCBI已公开的23个棉花MYB蛋白构建系统发生树,发现GhBlind1和GhBlind2与棉花大多数MYB蛋白遗传距离较远,和Blind同源蛋白组成一个较小的分支。     

茄子果色相关阿罗酸脱水酶基因的鉴定与表达分析

花青苷合成是植物苯丙烷类代谢途径的重要部分,苯丙烷代谢的前体物质苯丙氨酸合成最后一步反应的阿罗酸脱水酶(arogenate dehydratase, ADT)被认为是影响苯丙氨酸可用率的关键酶。本研究根据茄子基因组数据库基因注释检索ADT基因,并将茄子ADT基因氨基酸序列和拟南芥ADT基因编码的氨基酸序列进行同源比对、进化树分析;然后选取了6种不同果皮颜色的茄子自交系为试材,利用qPCR技术分析了ADT基因家族各成员在不同茄子果皮中的表达模式。结果表明,在茄子全基因组水平上鉴定到5个ADT基因,除SmADT3外,其余4个ADT基因编码的氨基酸序列高度保守。进化树分析表明,茄子SmADT2和SmADT5聚为1类,SmADT1和SmADT4聚为1类;其次,茄子SmADT1和拟南芥AtADT1高度同源,茄子SmADT4和拟南芥AtADT2高度同源。基因表达分析发现5个茄子SmADT基因在6种不同颜色果皮中均有表达,其中紫色品种中的表达量和花青苷合成关键酶基因SmANS、SmF3’5’H、SmDFR的表达趋势相同。相关性分析表明仅有SmADT2基因的表达量和6种茄子的果皮花青苷相对含量呈正相关...     

棉花中一个钝叶醇14α-脱甲基酶基因同源基因（GhCYP51G1）的克隆、序列特征和表达分析

为研究植物固醇在棉花纤维细胞生长发育中的作用和信号传导机制,通过筛选棉花EST数据库并对目标EST序列进行整合和分析,从陆地棉栽培品种徐州142正在发育的纤维中克隆了植物固醇合成途径的重要酶基因——钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因,命名为GhCYP51G1 (GenBank登录号为EU727154)。该基因编码486个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为55.2 kD和8.87。推导的氨基酸序列与烟草、马铃薯和葡萄等物种中CYP51家族成员有较高的同源性。而且具有钝叶醇14α-脱甲基酶序列中的典型保守结构域,如多个底物结合位点和血红素结合域。说明该克隆基因是钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因。实时定量RT-PCR的结果表明GhCYP51G1基因在快速伸长期的纤维中具有较高的表达水平,而在子叶、雌蕊和雄蕊以及开花后6 d胚珠、开花后0 d和2 d的胚珠纤维中表达水平较低。在开花后8 d的纤维细胞中GhCYP51G1的表达水平最高,这些结果说明该基因在纤维细胞的伸长生长中具有重要作用。同时在纤维生长过程中,由于生长素能够下调GhCYP51G1基因的表达,暗示植物固醇在植物激素,特别是油菜素类固醇物质和生长素的相互作用中具有一定作用。     

棉纤维发育相关转录因子的研究进展

 转录因子在棉纤维细胞分化发育过程中起重要的调节作用。近年来已经有多个与棉纤维发育相关的转录因子被研究报道,主要包括MYB、HD-ZIP、MADS、TCP等家族成员,其中研究最为广泛的为MYB类转录因子。GL1类的MYB转录因子和MIXTA类的MYB转录因子通过不同的调控方式参与对棉纤维细胞发育的调控。对这些转录因子的深入研究,对于揭示棉纤维细胞分化发育的分子机理具有重要的意义。本文就这方面的研究进展作一简要概述。     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子, 广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1(GenBank登录号: EF651783)。该cDNA序列长1 115 bp, 其开放读码框长度为771 bp, 编码256个氨基酸。表达特征分析表明, 该基因在陆地棉7235不同组织中均表达, 但表达量不同, 特别在开花前1 d, 开花后8 d和11 d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守, 但在非编码区差异较大, 在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝, 推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC₁作图群体, 将GhTF1定位在染色体10上。     

棉花纤维发育的分子机理及品质改良研究进展

 棉花纤维细胞的分化与发育是一个复杂有序的过程,在不同的发育时期均有大量的基因表达,参与纤维细胞发育的调控。转录因子和植物激素在棉纤维细胞分化起始过程中起重要的作用。纤维细胞壁结构、细胞骨架和糖类、脂类代谢相关的基因以及激素信号分子与纤维细胞的伸长密切相关。棉纤维次生壁合成时期主要是纤维素的合成及沉积过程,蔗糖合成酶和纤维素合成酶等基因在这一时期起关键的调节作用。在棉纤维发育分子生物学研究的基础上,利用基因工程改良棉花纤维品质也取得了一些研究进展。     

外源生育酚对棉花(Gossypium spp)纤维分化发育的影响

为探究生育酚的非抗氧化功能及其在棉纤维分化发育中的作用,本研究以陆地棉标准系TM-1的胚珠为材料,在BT培养基中加入不同种类和浓度的生育酚,通过胚珠离体培养诱导棉纤维分化发育,同时使用电子显微成像技术,研究外源生育酚对棉纤维分化发育的影响。胚珠离体培养和电镜扫描试验结果表明:胚珠经离体培养3 d后,4种外源生育酚对纤维细胞分化和发育均有促进作用;α-生育酚能显著地促进胚珠表皮纤维突起数量的增加,而γ-生育酚则促进纤维细胞的伸长;胚珠在离体培养条件下,浓度为1.0μmol/L的α-和γ-生育酚对棉纤维的分化发育的促进作用最为显著。本研究将为丰富生育酚的非抗氧化功能和验证生育酚在纤维的分化发育阶段所起的作用提供了理论依据。     

内源及外源植物激素对陆地棉无絮突变体胚珠纤维初始发育诱导效应的研究(英文)

采用陆地棉徐州１４２无絮突变体（ＦＬ）与其正常品种（ＷＴ）比较,研究了外源激素对离体胚珠纤维的诱导作用以及纤维初始发育过程中胚珠内源激素（ＩＡＡ,ＧＡ,ＡＢＡ和ｉＰＡ）含量的变化。结果表明,ＧＡ能够诱导离体的正常和突变体未受精和受精胚珠产生出纤维,开花前２ｄ～３ｄ的胚珠培养到天然开花日之后纤维方才突起。开花当天内源ＩＡＡ含量的急剧上升可能是胚珠表皮细胞迅速伸长的一个重要原因。开花前４ｄ到开花后４ｄ突变体胚珠内高水平的ｉＰＡ阻碍其纤维发生。     

棉花4个栽培种纤维初始发育的比较研究

利用扫描电镜技术,对棉花4个栽培种陆地棉（泗棉3号）、海岛棉（海7124）、亚洲棉（定远小花）以及非洲棉（A_1-50）开花前后的胚珠进行比较观察,并探讨延迟授粉对各棉种纤维初始发育的影响。结果表明,在南京大田气候条件下,除亚洲棉外其他3个棉种均在开花前1 d出现纤维细胞突起。在开花当天和开花后1 d,所有棉种的纤维突起（或伸长）密度均在珠柄顶部的脊突处最大,合点端和胚珠中部其次,珠孔附近最小。除陆地棉外,其他棉种在开花后1 d的纤维伸长密度均低于开花当天的纤维突起密度。说明随着棉胚珠体积的膨大,其他3个棉种胚珠表面的纤维细胞“稀释”程度大于陆地棉。在棉纤维初始发育阶段,纤维密度不仅受气象因子如温度的影响,而且与授粉时柱头的生活力密切相关;延迟授粉对纤维初始发育的影响以非洲棉较大,海岛棉较小,亚洲棉和陆地棉最小。本研究为理解棉纤维的分化和发育机理, 探讨4个栽培棉种纤维发育的亲缘关系,及人工授粉棉纤维的杂种优势利用提供了一定的理论依据。     

棉纤维发育突变体胚珠全蛋白及种子水溶性蛋白SDS凝胶电泳分析

 利用饱和酚法提取了棉纤维发育突变体胚珠的全蛋白以及种子水溶性蛋白,比较分析了不同发育时期棉花胚珠蛋白含量的变化。通过对野生型和纤维突变体全蛋白的SDS凝胶电泳图谱的比较分析,在二倍体棉种的突变体及其野生型间找到了三条可能与表皮细胞分化相关的差异蛋白条带,在种子水溶性蛋白中则发现了五条差异条带,为进一步研究与棉纤维分化相关的分子机制提供了参考。     

棉花溶血磷酸酯酰转移酶(LPAT)家族基因的发掘和表达分析

棉花油脂合成相关代谢在控制油分形成、纤维发育等进程中起着重要作用。溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是植物油脂代谢过程中的一个关键酶。本研究利用雷蒙德氏棉全基因组数据库,通过生物信息学技术,鉴定并获得8个棉花LPAT家族基因的全序列和染色体定位等信息。通过序列比对进行系统进化和分类分析,明确这8个家族基因分布在6条染色体上,分为4亚类,其中第I类和第III类中各含2个基因、第II类1个、第IV类3个。组织表达分析表明这8个基因在棉花营养和生殖阶段均表现表达多样性。LPAT6和LPAT8在17 d胚珠中表达水平很高,推测在油脂合成代谢调控中起重要作用。8个LPAT基因均在纤维中优势表达,其中LPAT2、LPAT3和LPAT4表达水平更高,推测LPAT家族基因的表达参与棉纤维发育进程。