避免基因组DNA污染的半定量RT-PCR新方法

为了消除基因组DNA的污染,在逆转录引物oligo-dT5’端加上通用引物T7B结合序列,根据3’-RACE的原理,用T7B和目标基因特异性引物即可进行半定量RT-PCR分析。用该方法对转GhGAI基因的拟南芥进行表达分析,结果表明:此方法可有效避免基因组DNA污染导致的假阳性。     

蚜虫基因RNAi载体的构建及其在转基因烟草中dsRNA的表达分析

RNAi机制可以通过dsRNA诱导同源mRNA的降解，从而导致该基因转录后沉默。RNA干扰作用从发现以来就具有了利用转录后基因沉默（PTGS）来进行抗虫的一种潜在可能性。针对dsRNA的这种作用，研究中提取蚜虫RNA，克隆出蚜虫Cathepsin B基因的干扰片段并构建出RNAi载体，转入本氏烟草中，在转基因烟草体内表达dsRNA。成功构建RNAi载体后，通过农杆菌转化和叶盘法将RNAi载体导入烟草中并采用组织培养方法培养出转基因烟草，通过PCR鉴定显示15株生根的转基因烟草中14株显示阳性。提取转基因烟草的RNA进行RT-PCR和Northern表达分析显示转基因烟草植株中dsRNA表达的存在。实验结果说明了在转基因植物体内表达RNAi载体可以产生dsRNA，从而在蚜虫进食植物时达到利用dsRNA抗蚜虫的作用。     

棉花开花前不同天数胚珠的采集标准检测

[目的]检测棉花开花前不同天数胚珠的采集标准,以期更清楚地研究棉花开花前后胚珠中基因的表达变化。[方法]采用花苞长、花苞宽、萼片长和萼片宽4种不同的参数来标准化陆地棉新陆早13号开花前不同天数棉花胚珠的特征。[结果]只有花苞长随花期的临近逐渐增长,而其他参数均没有明显变化。因此,选择花苞长为检测开花前不同天数胚珠的标准。统计分析表明,确定以1.0~1.2cm长的花苞为标准采集开花前5 d的胚珠,以1.3~1.5 cm长的花苞为标准采集开花前3 d的胚珠,以1.7 cm以上的花苞为标准采集开花前1 d的胚珠。[结论]该研究结果为后期试验中开花前胚珠样品的采集提供参考数据,也为更精确检测开花前后胚珠中基因表达的变化奠定了基础。     

拟南芥WUSCHEL基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

利用RT-PCR技术从拟南芥中扩增出WUSCHEL(WUS)基因,连接到诱导性表达质粒载体PINDEX3,构建出植物表达载体pIWUS,并通过农杆菌介导法导入烟草,PCR检测表明WUS基因已整合到烟草基因组中。     

棉花生长素应答因子ARF3功能的初步分析

生长素应答因子(auxin response factor,ARF)是转录因子的一个家族,在生长素信号传导途径中起着关键的作用。通过GenBank上登录的序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增得到了陆地棉生长素应答因子ARF3的全长序列,并构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,借助真空渗透转化技术,在农杆菌GV3101介导下转化模式植物拟南芥,经潮霉素筛选,得到了批量的转基因植株。通过PCR技术,检测到目的基因成功整合到拟南芥基因组中,RT-PCR检测到了目的基因在转基因植株中得到表达。     

PEG处理葡萄试管苗生理反应及叶片组织形态研究

应用不同浓度的聚乙二醇(PEG10000)处理红地球葡萄生根试管苗,在造成一定程度水分亏缺的情况下,观察葡萄试管苗的生理反应和植株生长、叶片形态解剖结构的变化。结果表明:在PEG处理下,葡萄生长发育迟滞,植株节间变短,株高变矮,但发根数量增加,根变长;新生叶片与对照比,叶片小而皱缩,气孔指数降低,上皮细胞排列更紧凑;同时葡萄试管苗脯氨酸的积累和内源ABA迅速增加。说明在一定强度的水分胁迫下,葡萄试管苗叶片的发育向增强其耐旱能力的方向进行,其渗透调节物质的积累是葡萄试管苗对长期水分胁迫的生理反应。     

海岛棉GbMFT1基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE技术,从新疆海岛棉品种新海14中克隆得到了一个MFT (MOTHER OF FT AND TFL1)类似基因,命名为GbMFT1基因(GenBank登录号为KC513744)。GbMFT1基因的开放阅读框(ORF)为528 bp,编码175个氨基酸的蛋白,含一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域。GbMFT1蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸。系统进化树分析表明GbMFT1编码产物与葡萄、番茄亲缘关系较近,属于同一进化分枝。实时荧光定量PCR分析表明,GbMFT1基因在棉花的不同组织中均有表达,在花瓣中的表达量较高;在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后2 d的胚珠、9 d的纤维中表达量最高。半定量RT-PCR结果表明,GbMFT1基因在刚萌发的种子中表达量高,用不同浓度的ABA处理种子后其表达变化不明显,表明GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

AtEDR1介导拟南芥对稻瘟菌的抗性(英文)

 稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)是一种半腐生病原菌,该病原菌可以侵染水稻,产生稻瘟病。对于水稻与稻瘟菌的互作机制,人们已经进行了大量的研究。然而,鉴于水稻基因组相对较大且稻瘟菌生理小种众多,致使研究进展缓慢。本研究通过将稻瘟菌生理小种Y34侵染拟南芥生态型Col-0,发现Y34可以感染Col-0,从而建立Y34-拟南芥互作模型,用以探究Y34与抗白粉突变体edr1的关系。结果显示,edr1比Col-0对于稻瘟菌更敏感。之前有研究表明,降低SA含量的突变体(pad4,sid2,nim1)均可抑制edr1相关表型。接种Y34于edr1与pad4、sid2、nim1形成的双基因突变体发现,所有双突变体的感病性比edr1单突均明显降低。推测EDR1可能在拟南芥抗稻瘟菌方面起一定正调控作用,且其作用依赖于SA途径的相关基因。     

新疆辣椒中BPEV和PCV2的鉴定与分析

 为明确新疆石河子辣椒感染病毒的种类,对表现明显皱缩、褪绿和卷叶等症状的辣椒样本进行长链非编码RNA(Long noncoding RNA, LncRNA)测序。根据LncRNA测序和RT-PCR检测,发现甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus, BPEV)、辣椒隐症病毒2(Pepper cryptic virus 2, PCV2)和辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)3种病毒。RT-PCR检测数据显示,新疆石河子的辣椒普遍感染BPEV和PMMoV。将BPEV的RdRp基因序列和PCV2-RNA1包含RdRp基因的序列分别进行核苷酸序列相似性和系统进化分析。结果表明本研究中BPEV-XJ和PCV2-XJ与其它分离物的相似性分别为89.1%~97.3%和96.9%~99.7%。BPEV-XJ与BPEV-TW分离物亲缘关系最近;PCV2-XJ与PCV2-DR分离物亲缘关系最近。辣椒中检测到BPEV和PCV2为新疆首次报道。