棉花黄萎病菌落叶型菌系研究

通过对我国棉花黄萎病菌 V_B 与已知的美国落叶型黄萎病菌 T_9以及我国非落叶型黄萎病菌 V_6、V_10进行对照比较研究,所得结果表明,菌系 V_B 为强致病力,病株落叶成光杆,在6个抗感不同的棉花寄主上致病,平均病情指数达54.6;对不同温度反应显示偏耐高温,适宜生长温度为20～30℃,最佳温度25℃;在 PDA 培养基上菌落白色,微菌核不明显,呈束状膨胀菌丝团等生理特性方面,均和美国落叶型黄萎菌 T_9表现趋于一致,而与非落叶型黄萎菌系差异明显。从而证实江苏常熟徐市的棉花黄萎菌系 V_B 是落叶型的病原菌。为综合防治提供科学依据。     

一种检测棉花黄萎菌毒素致萎性的新方法-叶片针刺涂抹法

用针在棉花叶片表面0.5 cm2的面积上刺15~20个小点,然后将黄萎菌毒素溶液涂抹于针刺部位,观察记载处理部位的萎蔫程度,由此检测黄萎菌毒素对棉花致萎性的强弱。利用层析纯化的黄萎菌V991毒素对棉花的致萎性试验表明:棉苗的子叶为最佳接种部位,毒素对陆地棉感病品种鄂荆3号的致萎下限为7.3μg,接种24 h即可表现萎蔫症状。用8个不同致病力黄萎菌系的培养滤液(简称滤液)针刺涂抹3个不同抗病性陆地棉品种,同时设置相应毒素浸泡参比试验。结果表明,利用培养滤液,即可以快速、准确地检测滤液的致萎力强弱,该方法既可用于棉花品种资源对黄萎病的抗性鉴定,又可用于比较黄萎病菌的不同生理型。     

荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育

为了研究黄萎病菌的侵染机制,通过农杆菌介导的转化方法,将绿色荧光蛋白基因sGFP导入落叶型黄萎病菌VD07038,将红色荧光蛋白基因mCherryRFP导入非落叶型黄萎病菌Bp2中,分别获得了具有绿色、红色荧光信号的阳性转化子。经过分子验证和连续继代培养,证明了这些转化子具有遗传稳定的对潮霉素的抗性。通过对转化子的菌落形态、生长速度和致病力进行检测,发现大部分转化子与野生型基本一致,少量转化子发生变异,其中转化子Bp2R-30不能产生微菌核,致病力显著下降。利用荧光显微镜观察了转化子VD07038G-10在感病棉花品种苏棉22幼苗根部的侵染情况。结果表明,在接菌12 h后VD07038G-10的孢子可吸附在根表面;接种7~9 d后,菌丝入侵到棉花根部的维管组织。本研究获得的荧光蛋白标记的棉花黄萎病菌VD07038G-10可用于实时观测黄萎病菌侵染棉花根系的过程,并且可以定量鉴定不同棉花品种对该菌系的抗性,为棉花黄萎病菌抗性鉴定提供一种新方法。     

院校合作研究发现棉花黄萎菌和大豆疫霉菌丝状病原体借助毒性蛋白破坏植物的水杨酸生物合成

<正>近日,江苏省农科院生物所张保龙研究团队与南京农业大学、山东大学合作研究发现两种丝状病原体借助于不同寻常的分泌效应蛋白破坏了植物的水杨酸生物合成。该研究解析了棉花黄萎菌和大豆疫霉菌的一个保守毒性蛋白的功能与其运出机制。黄萎菌造成棉花黄萎病,该病目前是国内棉花生产的最主要限制性因素;大豆疫霉为卵菌,     

用相互嫁接和定量PCR分析棉花对棉花黄萎病的抗性

为了研究棉花对棉花黄萎病的抗性机制, 本文选用对棉花黄萎病表现抗病的海岛棉(Gossypium barbadense)材料海7124和Pima 90及感病的陆地棉(G. hirsutum)材料冀棉11, 通过相互嫁接的方法构建试验系统, 用棉花黄萎菌对其人工接种, 利用Real-time quantitative PCR (qPCR)技术分析其在感病和抗病棉花中侵染的差别。相互嫁接试验中感/抗和抗/感组合的病情指数介于感/感和抗/抗对照之间, 且相互嫁接棉株各个部位的IC值(侵染系数)也多介于其对照相应部位之间; 并且病情指数与不同部位IC值显著相关, 说明棉花黄萎菌可以通过接口在抗-感之间扩展。感/抗嫁接组合试验说明抗病材料的茎基部在抑制病原菌扩展中起重要的作用, 而抗/感类型试验说明抗病材料接口以上部分也具有抑制病原菌增殖的作用。总之, 抗病海岛棉无论作为砧木还是接穗, 都能有效抑制病原菌的扩展, 说明抗病海岛棉对棉花黄萎菌具全株抗性, 但茎基部在抑制病原菌扩展中起重要的作用; 同样, 感/抗和抗/感组合试验也说明感病材料的各个部位均不能抑制病原菌的定殖和扩展。     

病原物协同致病性对棉花黄萎病严重度的影响

大丽轮枝菌是1种土传的维管束病原菌,由其引起的棉花黄萎病是我国棉花生产上最重要的病害之一。而最近发现了1种土壤习居的机会病原真菌棉帚霉菌能通过伤口侵入寄主,并与大丽轮枝菌协同加重棉花黄萎病严重度。棉帚霉菌能在营养非常贫乏的基质中产生分生孢子;超微结构观察也证实该病原菌在维管束组织中存在,并能产孢,显示了该真菌具有维管束病原菌的生物学特性。另外,土壤中的线虫活动可能使棉花根部产生伤口,也能促进病原菌的侵染。在总结分析生物学特性、侵染与互作机制等研究进展的基础上,提出建立棉花根围多病原物与寄主互作体系可深入研究棉帚霉菌与大丽轮枝菌协同致病机制的观点。     

棉花黄萎病拮抗细菌Bacillus subtilis ZL2-70抗菌蛋白的理化性质和抑菌机理

【目的】旨在研究棉花黄萎病拮抗细菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZL2-70抗菌蛋白的抑菌谱、理化性质以及抑菌机理,为棉花黄萎病生物农药的研制与开发奠定理论基础。【方法】采用抑菌圈法测定该抗菌蛋白的抑菌谱,以及温度、pH、无机离子、有机溶剂、蛋白酶对其稳定性的影响,并通过无菌小瓶等方法研究抗菌蛋白对大丽轮枝菌菌丝和孢子的抑制作用,测定了抗菌蛋白的纤维素酶和几丁质酶活力。【结果】棉花黄萎病拮抗细菌B.subtilis ZL2-70抗菌蛋白抑菌谱广,对19种植物病原菌表现出抑菌活性;该蛋白理化性质相对稳定,耐高温,在pH 5.0~10.0范围内抑菌活性较稳定,经EDTA处理后活性变化不大,对Fe3+敏感,对蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感;该抗菌蛋白对大丽轮枝菌的菌丝生长和孢子萌发有双重抑制作用,能使病原菌菌丝胞壁消融、原生质凝集渗漏、菌丝细胞泡囊化,并可抑制病菌孢子的萌发;抗菌蛋白具有纤维素酶和几丁质酶活性,且酶活力与抑菌活性有关。【结论】初步推断该抗菌蛋白通过多糖酶活力破坏大丽轮枝菌的细胞壁和抑制病原菌的孢子萌发而起到抑菌作用。     

河北省棉花黄萎菌落叶型和非落叶型菌系初步鉴定

利用PCR特异性扩增技术对从采自河北省的228株棉花黄萎菌(Verticillium dahliae)、四川省的2株棉花黄萎菌(菌株Sch-1和Sch-3)、辽宁省的1株黄萎菌(菌株Ly-1)、棉花黄萎菌标准菌株(落叶型标准菌株T9和非落叶型标准菌株V97)和3株棉花枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)菌株进行了落叶型和非落叶型菌系的鉴定.结果表明,利用V.dahliae特异性引物DB19/DB22从233株黄萎菌中均可获得500 bp的特异性片段,而3株棉花枯萎菌中不能获得扩增产物.分别利用非落叶型特异性引物INTNDf/INTNDr和落叶型特异性引物INTD2f/INTD2r对233株黄萎菌进行PCR扩增.菌株Sch-1、Sch-3、Ly-1及非落叶型黄萎菌标准菌株V97利用非落叶型特异性引物INTNDf/INTNDr可扩增出1 100 bp的产物;采自河北省的228株黄萎菌和落叶型标准菌株T9利用落叶型特异性引物INTD2f/INTD2r可扩增出450 bp的产物.结果表明,目前河北省主要棉区棉花黄萎病菌以落叶型黄萎菌菌株为主.     

棉花黄萎病相关基因GhAAT的克隆与功能鉴定

棉花黄萎病(Verticillium dahliae)是一种土传性真菌维管束病害,严重影响棉花的生产。本研究通过转录组数据分析筛选出一个与棉花黄萎病相关的氨基酸转运蛋白GhAAT基因,该基因在棉花根部响应黄萎病菌诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能。结果显示将该基因在棉花TM-1的叶片和根部沉默后,棉花对黄萎病抗性减弱,证明GhAAT基因参与调控了棉花抗黄萎病功能。发掘棉花抗黄萎病菌重要调控基因并揭示其分子机制对培育棉花抗病品种具有重要意义。     

棉花黄萎病菌毒素ELISA检测方法的建立及其应用

以纯化的棉花黄萎病菌毒素(PLPC)免疫新西兰白兔制备了PLPC特异性抗血清,建立了可特异性检测棉花黄萎病菌毒素的A蛋白双抗体夹心ELISA方法。应用建立的ELISA方法测定了病菌培养滤液、人工接种幼苗和大田病株不同组织中的毒素,结果表明:不同产毒能力菌株(VD 8和VD-5)在25℃下振荡培养3d后就能在培养滤液中检测到毒素,这比生物测定要早2～3d。将VD-8菌株的孢子以灌根方式接种泗棉3号幼苗5d后,就能从接种幼苗的茎杆和叶柄中检测到毒素,这比幼苗自然发病显症要早3～5d。在测定的30份大田病株茎杆、叶柄、叶脉样品中,阳性样品率为100%。这些结果表明建立的ELISA方法可用于菌株产毒能力的测定和大田棉花黄萎病的早期诊断。     

新疆乌苏地区棉花黄萎病菌分离鉴定和致病力分析

为了研究新疆乌苏地区棉花黄萎病菌的致病型和群体间的变异性,从该地区不同棉株上分离8株病原菌,通过对病原菌的菌落培养形态、菌丝和孢子的显微结构、对寄主的致病性、ITS序列的克隆、菌株间的系统进化及营养亲和性分析等方面进行了研究。结果表明：分离的病原菌均属于非落叶型棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae),为大丽轮枝菌;系统进化树显示8株菌在系统进化上属于2个不同的进化方式;8株黄萎病菌在相同的寄主上致病性存在差,Vd-1菌株致病力最强,Vd-34致病力最弱;不同致病力的菌株之间的营养亲和性分为2个营养亲和群(VCGs)。新疆乌苏地区棉花黄萎病的致病菌是大丽轮枝菌,病原菌在进化上差异显著。     

棉花黄萎病菌在土壤—植株微生态系中的分布

在土壤垂直分布中,棉花黄萎病菌主要分布于0~40 cm耕作层中,占总菌量的90%多,而40 cm以下土层中仅占总菌量的10%；在土壤水平分布中，棉花黄萎病菌随病害的加重，由聚积分布型转变为均匀分布型。在病株中,病菌分布也不均,叶脉>主茎>果枝。     

Effect of Pathogen Synergistic Pathogenicity on Severity of Verticillium Wilt of Cotton

Verticillium dahliae is a soil-borne and vascular pathogen causing Verticillium wilt of cotton, which is one of the most severe diseases affecting cotton production in China. Recently, a soil-inhabiting opportunistic pathogen was isolated and identified as Scopulariopsis gossypii; it could infect the host through wounds and increase disease severity in combination with V. dahliae. S. gossypii was able to form conidia in a nutritionally poor substrate and had similar biological characteristics to other vascular pathogens, while ultrastructure observation also confirmed that it was present in vascular tissue of cotton plants and produced conidia. Nematode activity in soil could cause wounds on the surface of cotton roots resulting in infection by the pathogens. On the basis of our analysis of the biological characteristics and infection process of S. gossypii and its interactions with other pathogens in cotton plants, we propose establishing a research program for multipathogen-host interactions in the cotton rhizosphere, which will enable detailed investigation of the synergistic pathogenesis of S. gossypii and V. dahliae.     

棉花黄萎病菌与抗黄萎病遗传育种研究进展

简要综述了棉花黄萎病菌及抗黄萎病遗传育种的研究进展。研究表明 ,各地的棉花黄萎病菌均存在致病力的分化 ,其致病机理是病菌侵入棉花后菌丝及孢子在导管内大量繁殖 ,同时刺激邻近的薄壁细胞产生胶状物质及侵填体而堵塞导管 ,使水分和养分运输发生困难 ,更重要的是病菌在棉株体内产生的糖蛋白毒素作用的结果。棉花抗黄萎病的遗传方式争论较大 ,但一般在温室由单一菌系接种鉴定时棉花黄萎病抗性表现为单基因遗传 ,而在田间病圃或用多菌系混合鉴定时 ,棉花黄萎病抗性表现为多基因遗传。由于陆地棉内缺乏高抗黄萎病资源 ,给棉花抗黄萎病育种带来一定困难 ,但 90年代以来 ,已育成 86 - 6、川 73 7、川 2 80 2、豫棉 1 9号、豫棉 2 1号等一些抗黄萎病的新品种。上述抗黄萎病品种在棉花黄萎病综合防治中起了重要作用     

酸不可溶性木质素和漆酶在棉花抗黄萎病中的作用

以抗病海岛棉Pima 90-53、耐病陆地棉冀棉20和感病陆地棉邯208为材料,研究黄萎病菌胁迫下棉花细胞壁的组织结构和木质素含量与棉花抗性的关系,并分析参与木质素合成的胞外漆酶的基因表达水平。结果发现,室内接种黄萎病菌24 h,在Pima 90-53的根部导管组织中没有发现病原菌的侵入,而在冀棉20和邯208的导管组织均有病原菌侵入;接种35 d时,Pima 90-53的茎部导管细胞壁高度木质化且导管堵塞不明显,冀棉20的导管细胞壁中度木质化且导管堵塞不明显,而邯208的导管细胞壁仅发生轻度木质化且导管堵塞严重。对田间病圃种植棉花叶片和叶柄的测定发现,3个品种的酸不可溶性木质素含量与品种的病情指数呈显著负相关(r = 0.99991^*),酸不可溶与可溶性木质素的比值大小与棉花品种黄萎病抗性强弱表现一致。基于此,进一步采用Real-time PCR技术分析参与木质素合成的漆酶基因GhLaccas表达差异发现,在冀棉20接种病菌后各检测时间点的表达量均显著高于邯208,且在冀棉20中GhLaccase表达量较0 h升高9~14倍,在8 h达到最高并在72 h内一直维持较高水平,表现出较高的应答效率。以上结果表明酸不可溶性木质素含量与黄萎病抗性呈正相关,漆酶在棉花抗黄萎病过程中起着重要作用。     

大丽轮枝菌致萎毒力指示菌的筛选及拮抗作用初探

为了筛选可指示Verticillium dahliae致萎毒素毒力大小的指示菌,并对致萎毒素抑制指示菌生长的机理进行初步探讨,采用指示菌平板打孔法,对黑曲霉(Aspergillus niger)BF-3758、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等12种具有微生物种属代表性的菌株进行筛选;采用拮抗试验、致萎试验结合显微观察的方法,初步探索了Verticillium dahliae致萎毒素对指示菌生长的抑制作用。结果表明,Verticillium dahliae粗毒素对Aspergillus niger BF-3758的生长具有较强的抑制作用,且该抑制作用和粗毒素对离体叶片的致萎作用具有一致性,并存在一定的量效关系,Aspergillusniger BF-3758菌株可以作为Verticillium dahliae致萎毒素的毒力指示菌;Verticillium dahliae粗毒素可抑制Aspergillus niger BF-3758的孢子萌发和菌丝生长,对成熟菌丝也有破坏作用。上述研究可为评价Verticillium dahliae的致病力提供一种操作简便、耗时短、费用低的生物学方法。     

一株棉花黄萎病拮抗芽孢细菌的分离鉴定及活性检测

 采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,得到一株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）具有较强的抑菌活性的拮抗细菌Z-5菌株。通过对该菌株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA的序列分析,确定拮抗细菌Z-5菌株为Bacillus malacitensis。盆栽实验表明Z-5菌株对大丽轮枝菌的防治效果达到76.05%,对棉花黄萎病具有明显的防治作用。     

大丽轮枝菌混合侵染棉花的研究

利用绒毛型变异体 (B型 )的形态特征 ,采用不同形态类型的菌株混合接种、再分离后分别进行致病力和营养体亲和性测定的方法 ,证明不同致病力的大丽轮枝菌菌株可以共同侵染同一株植物 ,在菌株间不同浓度混合比例的接种中 ,混合侵染率约占总侵染率的 1 /1 5至 1 /3。是一种研究不同致病力的菌株在寄主体内互作动态和分布情况的简便方法。由此提出在黄萎病研究中为防止不同致病力菌株对研究结果的干扰 ,应以使用单孢菌株为宜 ;由于形态变异体容易识别 ,在研究棉花黄萎病的交叉保护现象中可加以利用     

棉花抗黄萎病生理与生化机制研究

本文概述了棉花抗黄萎病的特点与规律,指出棉花植株是通过自身组织结构的强化、植物抗毒素的合成以及微生物之间的互作三方面应对黄萎病菌的侵染。认为棉花植株主要通过促进木质素生成和增加积累量以强化组织结构。在棉花抗病反应中以植物抗毒素的合成为主要途径,包括萜类、酶类和激素类3类化学物质,其中酶类物质如几丁质酶已经在很多植物中被证明具有抗病作用,但是其具体作用途径仍不清楚。土壤中某些微生物也可以对黄萎病菌产生作用。重点讨论了在棉花抗黄萎病信号通路中重要分子磷酸激酶和磷酸酯酶在植株抗性防卫中起着级联调控开关的作用,在现有信号调控研究基础上其在抗病机制中可能的参与途径。对目前棉花抗黄萎病分子育种研究中存在的主要问题和可能的解决途径进行了探讨,展望了其发展的方向。