山羊FSHR基因第10外显子的PCR-SSCP检测及其序列分析

利用PCR-SSCP技术检测山羊(Caprahircus)包括西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊173个个体FSHR基因第10外显子的单核苷酸多态性(SNP)。结果未发现SNP位点。测序后获得山羊FSHR基因第10外显子的核苷酸序列,并在NCBI数据库中获得GenBank登录No.DQ069909和DQ069910。通过DNA序列分析发现,FSHR基因第10外显子第120位碱基不存在C→T的转换,也不存在颠换等其它遗传变化。山羊、绵羊(OvisariesL.)和普通牛(Bostaurus)FSHR基因第10外显子序列同源性比较和聚类分析结果表明,山羊、普通牛和绵羊该部分序列的相似性最高为99.3%;在物种间比较中,绵羊和普通牛纯合子该基因外显子序列的不相似性最高为3.4%;据FSHR基因外显子序列构建的分子系统树结果显示,山羊、绵羊和普通牛物种内的个体各自聚为一类;山羊和绵羊先聚为一类,然后再与普通牛聚为一类。提示FSHR基因第10外显子的核苷酸序列适合于物种间的动物分子树的构建。     

山羊雌激素受体(ESR)基因部分外显子多态性分析

雌激素受体(estrogen receptor,ESR)与雌激素专一性地结合,并通过与雌激素的相互作用来调节生殖机能相关基因的表达,在动物繁殖中起着重要作用。研究采用PCR-SSCP和测序方法分析ESR基因外显子1、4在部分山羊(Capra hircus)品种中的单核苷酸多态性,并研究该基因对山羊繁殖力的影响。结果表明：ESR基因外显子1、4在所检测的济宁青山羊、波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊中均不存在多态性;山羊扩增片段核苷酸和氨基酸序列与人、牛、猪、马、绵羊、大鼠、小鼠和鸡8个物种的同源性分别为51.3%～97.3%和64.5%～98.3%;山羊ESR基因氨基酸序列存在2处特有突变,分别是外显子1第81位插入一个脯氨酸(P)和外显子4第4位由天冬氨酸突变为天冬酰胺(D4N)。哺乳动物ESR基因外显子1、4序列保守性强,该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。     

小尾寒羊MTNR1A基因外显子2的克隆与序列分析

对常年发情的绵羊品种小尾寒羊和季节性发情的绵羊品种多赛特羊共20只母羊的褪黑激素受体1A(melatonin receptor 1A，MTNR1A)基因外显子2的824 bp扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明, 小尾寒羊MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列与已发表的绵羊序列(GenBank登录号U14109)完全相同。小尾寒羊与多赛特羊MTNR1A基因外显子2的差异由5个变化的核苷酸(分别为C329T、G355T、C566T、C580A和A675G)组成，核苷酸同源性为99.4%。小尾寒羊与山羊、母牛、猪、人、小鼠、挪威大鼠、西伯利亚仓鼠和鸡之间MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列同源性为73.2%～98.5%，氨基酸序列同源性为78.5%～98.5%。     

棉铃虫线粒体cox2基因的克隆、序列及系统学分析

利用兼并性引物克隆出棉铃虫线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ基因(cox2),cox2基因编码框包含682个核苷酸,编码227个氨基酸的蛋白质;起始密码子为ATG,终止密码子仅有一个T组成。利用GenBank数据库搜索了其他12种昆虫的线粒体cox2基因序列,通过同源性比较,发现棉铃虫的cox2与鳞翅目4种蚕的cox2同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到85%~88%和93.0%~94.7%。同时,根据cox2核苷酸和编码的氨基酸序列进行了13种昆虫的分子系统学分析的探讨,发现分子系统树与形态分类基本一致,但略有差异。     

应用线粒体DNA序列探讨羚牛分类地位

为探讨羚牛分类学地位,应用聚合酶链式反应（PCR）扩增了羚牛、绵羊、山羊和斑羚（青羊）线粒体DNA（mtDNA）细胞色素b基因（Cyt b gene）,并测序,结合GenBank检索序列,对9种偶蹄类动物、1种奇蹄类动物Cyt b gene序列差异进行分析,构建了分子系统树（最优NJ树和唯一MP树）。通过本研究分析表明羚牛与羊亚科动物亲缘关系最近,将羚牛归入羊亚科较为合理。     

猪Fas基因的克隆及序列分析

从PK-15细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出猪F as基因,将其克隆到PM D 18-T载体上,进行序列分析。结果表明,克隆的猪F as基因序列与G enB ank上登录的猪F as基因同源性为100%,与人、牛、羊的F as基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为73.4%、79.2%、76.4%和56.2%、67.0%、64.6%。F as蛋白胞内区的死亡域,其氨基酸序列在猪、人、牛和羊的F as基因中呈现较高的同源性。     

鲤鱼品系的部分线粒体序列的遗传变异

运用PCR测序法,以9个我国常见鲤鱼（Cyprinus carpio）养殖品种和2个野生群体为研究材料,分析线粒体DNA的16S rRNA、Cyt b和D-loop序列片段,用于分析的序列共有1 457 个位点,其中变异位点32个,简约信息位点21个,共有单倍型16个。分别利用以上3个基因片段以及合并后的序列, 构建NJ和MP进化树。由不同方法获得相似的进化树,由不同基因片段得到的进化树均为两支,其中贝尔湖野鲤（BE）单独成支,其它群体聚为1支,只是由D-loop得到的进化关系更为详细,而由合并后的序列构建的进化树也与利用不同基因序列所得到的进化树并不矛盾。各品系间的分化时间约为3.03×104～1.21×105年前。根据序列的特征,16S rRNA的1个变异位点、Cyt b基因的4个变异位点和D-loop的14个变异位点可以作为鉴定不同的养殖品系和野生群体的SNP,证明mtDNA序列分析可以应用于品系的鉴定。     

Semi-nested PCR检测饲料中牛羊源成分

加强对进口饲料中牛羊源成分的检测是防止疯牛病和痒病传播的一个重要措施。根据已发表的牛和羊特异性基因及引物序列，分别设计了1条牛和羊特异性semi-nested PCR引物，并采用semi-nested PCR技术对饲料中的牛和羊成分进行了扩增检测。结果表明，semi-nested PCR能够扩增得到247 bp的牛特异性基因条带和214 bp的羊特异性基因条带，其对饲料中牛或羊源性成分的检测灵敏度可达到0.00001%～0.0001%，比普通PCR检测灵敏度要高出103倍；对牛或羊成分DNA的检测灵敏度可以达到10-6～10-5 ng，比普通PCR检测灵敏度要高出105倍以上。该技术具有快速、灵敏和结果稳定的特点，是检测饲料中痕量牛羊源成分的一种有效方法。     

转化生长因子β1基因(TGF-β1)外显子2的单核苷酸多态性及其与两个山羊品种产羔数的相关分析

为寻找与山羊(Capra hircus)产羔数密切相关的分子标记,加快山羊育种进程,研究转化生长因子β1基因(TGF-β1)遗传多态性与山羊产羔数的相关性,根据牛的TGF-β1基因序列设计3对引物,采用PCR-SSCP.和DNA测序技术检测山羊TGF-β1基因外显子2和内含子3的多态性,同时用最小二乘法研究了其多态性与产羔数的关系。结果表明,在波尔山羊和陕南白山羊中,仅第二外显子148bp位点碱基发生A→G的突变,导致苏氨酸(Thr)变为丙氨酸(Ala);多态位点均以A为优势等位基因,基因频率分别为0.530和0.648。在波尔山羊的1～3胎产羔数中,AB型个体的产羔数显著高于BB和AA型个体(P<0.05);在第四胎产羔数和平均产羔数中,AB型个体的产羔数显著高于AA(P<0.05),显著高于BB(P<0.05);BB型个体的平均产羔数显著高于AA型(P<0.05)。在陕南白山羊中,AB型个体的2～4胎产羔数和平均产羔数显著高于AA和BB型个体(P<0.05);在第一胎中,AB型个体显著高于AA型个体(P<0.05)。研究结果表明TGF-β1基因多态位点与产羔数显著相关,可以用于山羊分子遗传育种的候选基因。     

西农萨能羊骨桥蛋白基因OPN的筛选、克隆和生物信息学分析

摘　要: 采用抑制性削减杂交技术构建西农萨能羊乳腺组织在泌乳初期和泌乳高峰期的差异表达基因文库, 筛选泌乳初期和高峰期乳腺组织差异表达基因,通过RT-PCR方法克隆西农萨能羊乳腺组织OPN的CDs区序列,用实时定量PCR分析OPN基因的表达水平变化,并进行序列比对和功能预测。结果成功构建了西农萨能羊不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因文库,克隆了乳腺组织OPN基因, GenBank登录号为: EU295699, 开放读码框由834个碱基组成,编码277个氨基酸,前16个氨基酸为推定的信号肽区域。西农萨能羊OPN与绵羊(AF_152416)、牛(NM_174187)、人(DQ_846871)、小鼠(NM_009263) 相应基因核苷酸同源性分别为98%、95%、71%和70%,氨基酸同源性分别为：98%、91%、55%和54%,泌乳初期乳腺组织中mRNA表达水平是泌乳高峰期的5.03倍;预测西农萨能羊OPN较人和小鼠OPN多2个潜在功能基序。     

Size homoplasy and mutational behavior of chloroplast simple sequence repeats (cpSSRs) inferred from intra- and interspecific variations in four chloroplast regions of diploid and polyploid <Emphasis Type="Italic">Triticum</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">Aegilops</Emphasis> species

Chloroplast simple sequence repeats (cpSSRs) are widely distributed in the chloroplast genomes of all plant species, and are frequently employed for genotypic and phylogenetic analysis. However, information on intra- and interspecies variation in cpSSRs is lacking. In this study, we sequenced four intergenic (non-coding) chloroplast DNA regions in 57 accessions of 12 tetraploid, and 16 accessions of 4 hexaploid species of Triticum and Aegilops. These sequence data added to our previous data for diploid species in the same chloroplast regions. Intra- and interspecific genetic variation was analyzed for a total of 189 accessions of 13 diploid, 12 tetraploid, and 4 hexaploid species of Triticum and Aegilops, such that all species were represented by multiple accessions. The data were used to infer phylogenetic relationships within and among Triticum and Aegilops species. Based on this robust phylogenetic tree, seven of eight cpSSR loci clearly exhibited “size homoplasy,” referring to the fact that cpSSRs of identical size and DNA sequence can arise even if the alleles are not descended from a common ancestor. These data indicate that cpSSRs should be used with caution in phylogenetic analyzes. Interestingly, as observed from several previous studies, our data also suggest that observed mutation rates may increase significantly when mononucleotide (homopolymer) repeat numbers reach or exceed 9 bp. In the present report, using this sequence data set involving cpSSRs, 81 unique haplotypes among 189 accessions were detected, and five tetraploid Triticum and Aegilops species were successfully identified and genotyped. Our results indicate that combinations of nucleotide substitutions, indels and SSRs of chloroplast nucleotide sequences are available for genotyping at the species accession level.     

gBTN1A1基因的筛选、克隆及序列分析

利用抑制消减杂交技术研究西农萨能羊泌乳中期和末期的乳腺组织差异表达基因，构建消减文库，得到山羊嗜乳脂蛋白的部分序列，根据牛和绵羊基因组序列进行电子拼接，设计引物，得到山羊嗜乳脂蛋白的CDs区全序列，应用RT-PCR技术从山羊乳腺组织总RNA中扩增克隆了山羊嗜乳脂蛋白基因CDs区，命名为gBTN1A1,并登录Genbank（EF102891）。gBTN1A1全基因由7个外显子和6个内含子组成，开放读码框由1581个碱基,编码526个氨基酸，gBTN1A1基因核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性为97%, 88%, 84%，蛋白质序列的同源性为96%, 84% and 70%。其二级结构、跨膜区域及信号肽分析与牛、人和鼠相似，所以推测gBTN1A1与乳脂肪球的分泌密切相关，根据其在泌乳期表达丰度的差异推测其可能影响山羊产奶量。     

绵羊mtDNA D-环序列与微卫星DNA遗传多样性和系统发育分析

采用mtDNA D-环序列和微卫星DNA两种标记方法,对9个绵羊群体225只个体进行遗传多样性和系统发育分析。结果表明：两种方法在遗传多样性分析中得出的结论一致,即在研究的9个绵羊群体中青海藏羊的遗传多样性最丰富,而湖羊和岷县黑裘皮羊遗传多样性都较低。但在系统发育分析中,通过mtDNA D-环序列和微卫星DNA座位数据构建系统发育树,结果表现为很大的不同。由于微卫星DNA符合孟德尔遗传规律,能够反映群体间的亲缘关系,构建的系统发育树结构可靠。mtDNA是核外遗传物质,具有母系遗传的特点,在反映群体间的亲缘关系上不具优势。此外,青海细毛羊和甘肃高山细毛羊的育种实践表明它们的遗传来源相似,亲缘关系相近,这与微卫星DNA座位数据构建系统发育树反映的结果一致,因此,在群体的亲缘关系研究上,微卫星DNA数据分析的结果比mtDNA序列分析结果更可信。172个单倍型序列网络关系分析表明研究的9个绵羊群体可能有三个母系起源。     

藏绵羊MHC-DRB1基因第3外显子的PCR-SSCP检测及其序列分析

为了研究藏绵羊DRB1基因第3外显子多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、变异类型和各等位基因间的遗传关系,本研究采用PCR-SSCP方法,分析了500只藏绵羊(Ovis aries)DRB1基因第3外显子多态性,并对不同等位基因进行克隆和测序。结果表明,藏绵羊DRB1基因第3外显子表现了8个等位基因,8个单倍型序列分析发现了15个核苷酸多态位点,与GenBank序列对比分析,有7个DRB1的等位基因是首次发现。8个DRB1第3外显子的单倍型序列NJ系统发育树呈2支分化趋势。3个种群藏绵羊中B均为优势等位基因,该位点PIC>0.5,为高度多态且显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。研究认为,藏绵羊DRB1基因第3外显子具有丰富的多态性;藏绵羊DRB1基因最初是由2个等位基因突变分化成两大类等位基因。     

基于线粒体COⅠ及Cyt b基因的7种龙虾类分子系统关系

运用PCR法扩增湛江沿海海域7种龙虾的线粒体COⅠ和Cytb基因并对其序列进行分析,以分析7种龙虾的分子系统关系。从7种龙虾中扩增到的COⅠ基因片段长度均为650bp,共存在224个核苷酸位点变异,变异率为35.22%,简约信息位点161个;扩增到的Cytb基因片段长度均为536bp,共存在148个核苷酸位点变异,变异率为29.48%,简约信息位点66个。所有的扩增序列中,没有发现碱基的缺失以及插入,序列中的转换大于颠换,且碱基替换多发生于密码子的第3位。以帝加洛真龙虾（Palinurus delagoae）、普通真龙虾（Palinurus elephas）、吉氏真龙虾（Palinurus gilchristi）为外群,对COⅠ和Cytb两个基因序列采用最大简约法（maximum parsimony,MP）和贝叶斯推论法（bayesian inference,BI）构建龙虾类分子系统树。结果显示：日本龙虾和密毛龙虾亲缘关系比较近,而其它5种龙虾与真龙虾属的3种关系较近,与传统的分类存在一定分歧。     

山羊卵泡细胞中bFGF基因表达和bFGF cDNA部分序列分析

摘要：建立了一种检测山羊(Caprane)卵泡中bFGF基因表达的RT-PCR技术。检测了在不同大小的山羊卵泡中bFGF基因表达情况。结果表明，在不同大小的卵泡细胞、卵丘卵母细胞复合体、颗粒细胞和卵泡膜中都检测到了bFGF的基因表达。同时，对山羊卵泡中的bFGF cDNA部分序列进行了序列分析，并与牛和人的相应序列进行了比较，表明它们具有高度的序列相似性。     

山羊卵泡细胞中bFGF基因表达和bFGF cDNA部分序列分析

建立了一种检测山羊(Caprane)卵泡中bFGF基因表达的RT—PCR技术。检测了在不同大小的山羊卵泡中bFGF基因表达情况。结果表明，在不同大小的卵泡细胞、卵丘卵母细胞复合体、颗粒细胞和卵泡膜中都检测到了bFGF的基因表达。同时．对山羊卵泡中的bFGF cDNA部分序列进行了，序列分析，并与牛和人的相应序列进行了比较，表明它们具有高度的序列相似性。     

催乳素基因多态性及其与小尾寒羊高繁殖力关系的研究

设计5对引物，采用PCR-SSCP技术检测催乳素（prolactin，PRL）基因外显子1至外显子5在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力绵羊品种（多赛特、特克塞尔和考力代）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。通过克隆测序首次获得了绵羊PRL基因外显子全序列。结果表明：外显子2在5个绵羊品种中均存在单核苷酸多态性，而其它4个外显子只在湖羊中存在单核苷酸多态性。本研究初步表明小尾寒羊PRL基因外显子2的CC型平均产羔数分别比CD型和DD型多0.39只（P<0.05）和0.98只（P<0.05），CD型和DD型小尾寒羊平均产羔数差异不显著（P>0.05）。     

西农萨能奶山羊gBTN1A1基因的筛选、克隆及序列分析

利用抑制消减杂交技术研究同一只西农萨能奶山羊泌乳中期和末期的乳腺组织差异表达基因,以泌乳中期乳腺cD-NA为测试组,末期乳腺cDNA为驱动组,构建消减文库,得到山羊(Capra hircus)嗜乳脂蛋白基因的部分序列。根据牛(Bos)和绵羊(Ovisaries L.)基因组序列进行电子拼接,并设计引物,得到山羊嗜乳脂蛋白基因的CDs区全序列,应用RT-PCR技术从山羊乳腺组织总RNA中扩增克隆了山羊嗜乳脂蛋白基因CDs区,命名为gBTN1A1,并登录GenBank(EF102891)。gBTN1A1基因开放读码框由1581个碱基组成,编码526个氨基酸,前26个氨基酸为推定的信号肽区域。gBTN1A1基因核苷酸序列与牛(NM-174508)、人(NM-001732)和鼠(AK145168)的同源性分别为97%、88%和84%,氨基酸序列的同源性分别为96%、84%和70%。其二级结构、跨膜区域及信号肽分析均与牛、人和鼠的BTN1A1基因相似。     

Establishment and application of a fluorescent polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method for identifying porcine,caprine, and bovine meats

A method of fluorescent Polymerase Chain Reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was applied as an analytical and quantitative tool for meat identification. Following alignments of the nucleotide sequences, an oligonucleotide primer pair was designed to amplify the partial sequences within the 12S ribosomal RNA (12S rRNA) gene of mitochondrial DNA from porcine, caprine, and bovine meats. No fragment can be amplified from dog, cat, fish, duck, goose, turkey, and chicken DNA with the primer pair. Using fluorescence sensor capillary electrophoresis, the species-specific DNA fingerprints of pork, goat, and beef were generated by restriction enzyme digestion following a fluorescence-labeling PCR amplification. Species identification was conducted on the meat mixtures. The reliably semiquantitative levels were below 1% for binary mixtures of pork, goat, and beef. Cooking and autoclaving of meats did not influence the generation of the PCR-RFLP profiles or the analytical accuracy.