小鼠TLR3基因双敲除打靶载体构建及巨噬细胞RAW264.7~(TLR3-/-)细胞系的建立

【目的】建立Toll样受体3(TLR3)基因缺失的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,为探索狂犬病毒感染机体过程中TLR3在固有免疫反应中的作用机制提供理论依据。【方法】采用Golden Gate Kit试剂盒组装转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)打靶载体p TALEN-TLR3,经酶切和测序验证其连接正确后,通过脂质体瞬时转染RAW264.7细胞,转染后提取细胞DNA,用T7核酸内切酶酶切验证TALEN质粒剪切活性。【结果】TALENs左右臂分两部分连接,首先完成A、B部分的各自连接,然后分别将T1LA与T1LB、T1RA与T1RB、T2LA与T2LB、T2RA与T2RB连接,TALEN模块经过两次连接后的PCR鉴定结果显示,T1L、T1R和T2L的4个克隆均呈阳性,T2R有3个克隆呈阳性。T2L和T2R质粒共转染RAW264.7细胞后提取DNA为模板,经PCR扩增后用T7核酸内切酶进行酶切,酶切后的DNA电泳结果显示TALEN2剪切活性较强,共获得3条条带(931、555和376 bp)。TALEN打靶载体p TALEN-TLR3转染RAW264.7细胞24 h后用胰酶进行消化,并加入800μg/m L G418进行筛选,7 d后获得细胞单克隆;挑选阳性细胞克隆进行T7核酸内切酶酶切鉴定及测序,结果发现4-1和4-40号细胞克隆为双敲细胞系,均缺失7 bp的核苷酸碱基,为非3整数倍碱基缺失,可造成后续基因移码突变,使细胞基因功能失活。【结论】通过TALEN技术可成功构建TLR3基因双敲除的小鼠巨噬细胞RAW264.7TLR3-/-细胞系,且可用于狂犬病毒感染细胞后细胞因子和TLR3间的关系研究。     

猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

杜梨不定根形成相关基因PbARRO-1的克隆及定量表达分析

以杜梨叶片为试材,采用同源序列和RACE技术克隆了梨ARRO(adventitious rooting related oxygenase)基因,并进行了基因的生物信息学和时空表达分析,以期对梨属植物不定根产生研究提供帮助。结果表明:PbARRO?1基因开放读码框全长831bp,编码276个氨基酸,相对分子量为30.535 9kD,等电点pI为5.53;推导氨基酸序列同源性分析显示该基因与苹果、梅花、毛果杨等具有较高同源性,其中苹果达到92%。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在秋子梨根、茎、叶中均有表达,叶片中表达量初期较高,后期较低;茎中表达量则呈现先升高后降低的趋势,在第15天达到峰值,推测PbARRO-1基因与茎上不定根的形成密切相关。     

小杂粮在宁夏区域经济发展中的地位和作用

1宁夏小杂粮种类和分布 小杂粮是指生育期短，地域性强，种植方法特殊，面积较小，有特殊用途的小宗粮豆，包括豆类（豌、扁、蚕豆，草豌豆、芸豆、绿豆、红小豆），粟类（如糜子、谷子），麦类（大麦、莜麦、青稞、高粱等）和荞麦类（甜荞、苦荞）等数十种。宁夏山区主要有豌豆，蚕豆，扁豆，草豌豆，糜子，谷子，荞麦，莜麦8种，高粱原来银川平原种植，近年面积大幅度减小，山区种植以产草为主。     

挤羊奶"十要点"

给母羊挤奶要做到每天定时、定人、定场地，不宜随便变动。此外，挤奶的环境还要保持安静。     

关于返贫问题研究

甘肃省农村扶贫从1955年中部地区享受国家返销粮开始,到70年代初这种救济工作达到了高潮.大量及时的救济,在帮助群众克服生产、生活困难方面起到了积极作用,但是无法从根本上解决问题.……     

4个多年生黑麦草品种对干旱胁迫的生理响应

为研究不同品种多年生黑麦草(Lolium perenne)的抗旱能力,选取4个多年生黑麦草品种,采用水培试验的方法,在温室利用PEG-6000模拟干旱胁迫,测定多年生黑麦草的草坪质量、地上部与地下部增长量、含水量、叶绿素含量以及抗氧化酶活性等生理指标。研究表明,干旱胁迫至10 d时,4个多年生黑麦草品种生长均受到明显抑制,同时4个品种的植株含水量都处于下降的趋势。此外,4个品种中超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶活性都出现了先上升后下降的趋势,丙二醛含量增加。利用隶属函数分析法进行抗旱性评价。结果表明,4种多年生黑麦草的抗旱能力强弱表现为Pr521>维达斯>百灵鸟>Pr525。     

MicroRNA研究概述

MicroRNA(miRNA)是一类真核生物内源性非编码的单链小分子RNA,长约21nt~23nt。越来越多的miRNA在动物细胞和植物组织中发现,这些成熟的小分子RNA是从具有发夹结构的前体miRNA(pre-miRNA)剪切出来,通过与靶mRNA分子互补结合而抑制蛋白翻译或导致mRNA降解,从而调控靶基因的表达。miRNA是一类重要的基因调控子,在机体的基因表达调控、细胞分化和凋亡以及抗病毒防御中发挥重要的作用。深入理解miRNA介导的宿主与病毒之间的相互调节作用,对于阐明病毒的致病机理与制定治疗策略具有深远的意义。     

玉米孕穗期的管理要点

<正>孕穗期是玉米营养生长与生殖生长并进的时期,搞好这时期的田间管理,对于提高玉米产量起着至关重要的作用。其关键管理措施如下。 1、重施孕穗肥玉米孕穗期,是雌穗小穗、小花分化的盛期,是决定果