西农萨能奶山羊gBTN1A1基因的筛选、克隆及序列分析

利用抑制消减杂交技术研究同一只西农萨能奶山羊泌乳中期和末期的乳腺组织差异表达基因,以泌乳中期乳腺cD-NA为测试组,末期乳腺cDNA为驱动组,构建消减文库,得到山羊(Capra hircus)嗜乳脂蛋白基因的部分序列。根据牛(Bos)和绵羊(Ovisaries L.)基因组序列进行电子拼接,并设计引物,得到山羊嗜乳脂蛋白基因的CDs区全序列,应用RT-PCR技术从山羊乳腺组织总RNA中扩增克隆了山羊嗜乳脂蛋白基因CDs区,命名为gBTN1A1,并登录GenBank(EF102891)。gBTN1A1基因开放读码框由1581个碱基组成,编码526个氨基酸,前26个氨基酸为推定的信号肽区域。gBTN1A1基因核苷酸序列与牛(NM-174508)、人(NM-001732)和鼠(AK145168)的同源性分别为97%、88%和84%,氨基酸序列的同源性分别为96%、84%和70%。其二级结构、跨膜区域及信号肽分析均与牛、人和鼠的BTN1A1基因相似。     

西农萨能羊骨桥蛋白基因OPN的筛选、克隆和生物信息学分析

摘　要: 采用抑制性削减杂交技术构建西农萨能羊乳腺组织在泌乳初期和泌乳高峰期的差异表达基因文库, 筛选泌乳初期和高峰期乳腺组织差异表达基因,通过RT-PCR方法克隆西农萨能羊乳腺组织OPN的CDs区序列,用实时定量PCR分析OPN基因的表达水平变化,并进行序列比对和功能预测。结果成功构建了西农萨能羊不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因文库,克隆了乳腺组织OPN基因, GenBank登录号为: EU295699, 开放读码框由834个碱基组成,编码277个氨基酸,前16个氨基酸为推定的信号肽区域。西农萨能羊OPN与绵羊(AF_152416)、牛(NM_174187)、人(DQ_846871)、小鼠(NM_009263) 相应基因核苷酸同源性分别为98%、95%、71%和70%,氨基酸同源性分别为：98%、91%、55%和54%,泌乳初期乳腺组织中mRNA表达水平是泌乳高峰期的5.03倍;预测西农萨能羊OPN较人和小鼠OPN多2个潜在功能基序。     

猪小脂肪细胞因子1（SMAF1）基因cDNA的克隆及表达谱分析

采用比较基因组学和RT-PCR方法，根据人和小鼠SMAF1基因的保守序列，设计简并引物，克隆了猪SMAF1基因的cDNA序列。所克隆片断全长256bp（GeneBank登录号 DQ191892），包括一个编码了81个氨基酸的完整编码区，该序列与人和小鼠的SMAF1基因的相似性分别为86%和78％，预测的氨基酸序列与人、小鼠、大鼠和牛的相似性分别为81％、67％、70%和84%。猪SMAF1基因在脂肪组织中高丰度表达，在4月龄瘦肉型猪（大白猪）脂肪组织中的表达量显著低于脂肪型猪（梅山猪）（P＜0.05）。本研究结果表明，猪SMAF1基因可能具有和其它物种SMAF1基因相似的功能，推测其在脂肪细胞发生和/或脂肪细胞功能中具有重要的调控作用。     

小尾寒羊MTNR1A基因外显子2的克隆与序列分析

对常年发情的绵羊品种小尾寒羊和季节性发情的绵羊品种多赛特羊共20只母羊的褪黑激素受体1A(melatonin receptor 1A，MTNR1A)基因外显子2的824 bp扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明, 小尾寒羊MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列与已发表的绵羊序列(GenBank登录号U14109)完全相同。小尾寒羊与多赛特羊MTNR1A基因外显子2的差异由5个变化的核苷酸(分别为C329T、G355T、C566T、C580A和A675G)组成，核苷酸同源性为99.4%。小尾寒羊与山羊、母牛、猪、人、小鼠、挪威大鼠、西伯利亚仓鼠和鸡之间MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列同源性为73.2%～98.5%，氨基酸序列同源性为78.5%～98.5%。     

西农萨能奶山羊激素敏感脂酶基因CDS区的克隆与生物信息学分析

根据GenBank已收录的牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种激素敏感脂酶(HSL)基因序列的同源保守区域,设计特异性引物,利用RT-PCR技术,从西农萨能羊乳腺组织中克隆得到了山羊(Caprar hircus)HSL基因的CDS,并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列以及蛋白质结构进行了生物信息学分析.结果表明,山羊HSL基因CDS全长2 271 bp,编码756个氨基酸残基(GenBank登录号为:EU273879),与牛、人和小鼠的核苷酸序列同源性分别为96%、86%和79%;氨基酸序列的同源性分别为96%、85%和83%;其蛋白质的分子量为82 583.7 D,等电点为6.23,其氨基酸序列中存在较强的疏水区域,三级结构存在一个α/β水解酶折叠区域,该特征与牛、人及小鼠的HSL基本一致.     

西农萨能羊胰岛素诱导基因2(INSIG2)的克隆及组织表达分析

胰岛素诱导基因2(insulin induced gene2,INSIG2)是参与脂质形成和代谢调控的重要基因,而山羊乳腺中脂质合成和代谢与乳品质密切相关。为进一步明确它们之间的关系进而为改善山羊乳品风味提供科学支持。本实验以西农萨能羊(Capra hircus)乳腺组织为研究材料,采用RT-PCR技术克隆山羊INSIG2基因,并采用实时荧光定量(RT-qPCR)技术在山羊10个组织中对INSIG2基因进行了组织表达分析。研究获得了915bp的cDNA序列(GenBank登录号:JQ361767),其中编码区678bp,该基因编码225个氨基酸,预测蛋白质分子量为24.8730kD,等电点(pI)为8.77。通过核苷酸和氨基酸序列比对分析发现,山羊的INSIG2与GenBank中牛(Bos taurus)的相似性最高。蛋白质结构分析显示,INSIG2存在6个跨膜螺旋;疏水性分析发现,其N端和C端均具有亲水性;遗传距离分析发现,山羊与牛的亲缘关系最近,其次是猪(Susscrofa)。INSIG2基因的组织表达分析表明,INSIG2基因在10个被检测组织中均有表达,且肺组织中表达量最高,肌肉次之,乳腺组织的表达量居中,心脏组织中最低。研究结果为该基因在山羊乳腺组织中的功能研究提供依据。     

调控山羊乳腺脂肪酸代谢miRNAs筛选及相关pri-miRNAs克隆验证

microRNA(miRNA)是调控脂类代谢的重要分子。本研究采用数据库预测和自由能分析法,筛选与山羊(Capra hirus)乳腺脂肪酸代谢相关的miRNA,并对预测得到的miRNA进行克隆验证。预测结果表明,通过MicroCosm、TargertScan和PicTar3个在线数据库预测与山羊脂肪酸代谢相关的30个基因相对应的miRNA,预测得到50条miRNA,其中3个数据库预测一致的miRNA为13条,2个数据库预测一致的为37条。结果显示,脂肪酸合酶基因(FASN)对应4个不同的miRNA,嗜乳脂蛋白基因(BTN1A1)对应2个,而磷酸甘油酰基转移酶6基因(AGPAT6)没有预测到miRNA靶位点;FASN与BTN1A1的3’UTR上miR-103的结合位点分别有3个和2个。通过MFOLD软件对预测所得的50条miRNA靶位点两侧序列的自由能(ΔG>-20kcal/mol)进行分析,9种miRNA与调控脂肪酸代谢基因相关度较高,分别为miR-103/BTN1A1、miR-15/FASN、miR-23/LPL(脂蛋白酯酶)、miR-27/PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体)、miR-29/GPR41(短链脂肪酸受体)、miR-146/BTN1A1、miR-195/FASN、miR-200/SCD(硬脂酰辅酶A去饱和酶)和miR-497/GPR41,其中miR-103/27/195分别位于BTN1A1、PPARγ和FASN的靶位点与已知物种间同源性较高,增加了这些miRNA/mRNA结合的可能性。此外,靶位点单侧和双侧ΔG小于阈值的miRNA/mRNA分别为14对和9对,其中miR-27/mRNA预测的靶基因为4个,依次为FASN、ACOX1(乙酰辅酶氧化酶基因1)、LPL和PPARγ,miR-103和miR-15的靶基因同为FASN、BTN1A1和ACOX1。以西农萨能奶山羊(Capra hirus)基因组DNA为模板,可扩增出与5条miRNA(miR-103-1/23a/27a/146b/200a)分别相对应的初级miRNA(pri-miRNA);通过序列分析和二级结构分析表明,5条pri-miRNA均包含完整的pre-miRNA序列,同时具有典型的茎环结构,能够产生相应的miRNA。与牛的同源性分析表明,除pre-miR-27a同源性为98%外(山羊pre-miR-27a3’端第11个碱基为G,而牛为A),其余4条pre-miRNA同源性均为100%。因此,本研究筛选的9种miRNA可能调控山羊乳腺脂肪酸代谢,克隆的5条pri-miRNA为其功能研究提供基础。     

棉花GhBI-1基因全长cDNA的克隆与表达分析

BI-1（Bax inhibitor-1）是广泛存在于生物体中控制细胞凋亡的抑制因子。过表达BI-1基因能够提高植物抵御病原体侵害和抗逆境的能力。本研究利用已知的部分BI基因序列,通过RACE获得2个全长cDNA序列,分别命名为GhBI-1a与GhBI-1b。序列分析表明,2个基因的核酸序列同源性达到86%,氨基酸序列同源性达到87%,GhBI-1a蛋白有6个跨膜区域,GhBI-1b有7个跨膜区域;2个GhBI-1基因在不同组织中均表达,GhBI-1a在接菌诱导后表达量没有变化,而GhBI-1b接菌后表达量上调;通过与棉属其他物种的核酸序列进行比对,推测GhBI-1a基因位于异源四倍体棉的D染色体亚组,而GhBI-1b位于A染色体亚组。     

山羊雌激素受体(ESR)基因部分外显子多态性分析

雌激素受体(estrogen receptor,ESR)与雌激素专一性地结合,并通过与雌激素的相互作用来调节生殖机能相关基因的表达,在动物繁殖中起着重要作用。研究采用PCR-SSCP和测序方法分析ESR基因外显子1、4在部分山羊(Capra hircus)品种中的单核苷酸多态性,并研究该基因对山羊繁殖力的影响。结果表明：ESR基因外显子1、4在所检测的济宁青山羊、波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊中均不存在多态性;山羊扩增片段核苷酸和氨基酸序列与人、牛、猪、马、绵羊、大鼠、小鼠和鸡8个物种的同源性分别为51.3%～97.3%和64.5%～98.3%;山羊ESR基因氨基酸序列存在2处特有突变,分别是外显子1第81位插入一个脯氨酸(P)和外显子4第4位由天冬氨酸突变为天冬酰胺(D4N)。哺乳动物ESR基因外显子1、4序列保守性强,该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。     

水牛促卵泡素受体(FSHR)基因5′端侧翼序列的克隆与分析

促卵泡素(FSH)是动物脑垂体分泌作用于卵巢卵泡生长、发育、分化、成熟和排卵的重要繁殖激素。由于是生物大分子,不能透过细胞膜,FSH必须与靶细胞膜上的促卵泡素受体(FSHR)结合,经过受体介导将信息传递到靶细胞内,才能发挥其生物学功能。目前国内外已对牛、山羊等多种动物的FSHR基因的cDNA序列进行了克隆测序,但是关于水牛FSHR基因5′端侧翼序列还未见报道。本研究对水牛FSHR基因5′端序列进行克隆和序列分析,其目的是寻找水牛FSH受体基因的SNP突变位点,从而为以后进行FSH受体基因的多态性分析和探索该受体基因在水牛繁殖中的可能作用打下基础。由水牛血液中提取DNA,与根据牛FSH受体基因序列设计的特定引物进行PCR反应,以合成FSHR 5′端侧翼调控区,扩增的该片断经分离、回收和纯化后再插入到pMD18-T质粒中,筛选阳性克隆,将插入了FSHR 5′端侧翼端片断的质粒纯化后进行序列测定和分析,弄清核苷酸序列和假定的氨基酸顺序并通过GeneBank进行同源性分析。结果表明,PCR扩增获得的片段为939 bp,与中国西门塔尔牛该段序列相比,同源性为97.44%,在-720 bp处的1个碱基缺失;与山羊的FSHR基因比较,同源性为94.78%,在-625~-619 bp处有7个碱基的插入;在此激素反应元件3′端一段序列(-530~-526 bp)水牛和山羊的相同均为TGACC,而西门塔尔牛为CGACC,但三者5′端一段序列(-679~-675 bp)没有突变并且相同,均为GGTCA;与人和大鼠FSHR基因不同的是,在牛、水牛和羊的FSHR基因启动子区检索出了TATA盒基元和多个类CAAT盒序列,且在水牛、山羊和牛之间没有碱基差异。因此,对水牛FSHR基因转录启动和表达调控值得进一步研究。     

西农萨能羊47kD尾部相互作用蛋白基因(TIP47)的cDNA克隆、序列结构分析与组织表达

47kD尾部相互作用蛋白基因(tail-interacting protein47,TIP47)是影响脂滴形成和代谢的重要基因。本实验以西农萨能羊(Capra hircus)的乳腺组织为研究材料,采用RT-PCR和RACE,克隆了山羊TIP47基因的cDNA全长序列。结果得到TIP47基因cDNA序列全长1906bp(GenBank收录号为:HQ846827),包括5'UTR82bp,完整编码区1314bp及3'UTR510bp,编码蛋白质的氨基酸数为437,分子量47.36kD,等电点(pI)5.14。对TIP47基因的核苷酸和氨基酸序列分析发现,山羊的TIP47与GenBank中牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和猪(Sus scrofa)的TIP47相似性较高。蛋白质结构分析显示,TIP47不存在信号肽序列和跨膜结构;疏水性分析发现,其N端疏水性较强,中间靠近C端部分亲水性较强;三级结构分析发现,其C端呈大写的L形;该基因的遗传距离分析发现,山羊与牛的亲缘关系最近,其次是猪和人。通过RT-qPCR技术对TIP47基因进行了组织表达分析,发现所检测...     

绵羊GlyCAM-1基因克隆、核苷酸变异及其组织表达分析

糖基化依赖细胞粘附分子(GlyCAM-1)是粘液素(mucin)糖蛋白家族的成员,是乳腺细胞合成的一种乳脂球膜蛋白(MFGMPs)的重要组成部分。GlyCAM-1在乳腺发育和泌乳中发挥着重要作用,为探究该基因的序列特征、核苷酸序列变异和表达特征,以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空怀期)和低泌乳量的甘肃高山细毛羊(泌乳高峰期)的乳腺组织为研究对象,利用克隆测序、RT-qPCR、生物信息学等方法克隆绵羊GlyCAM-1基因的编码区,分析GlyCAM-1的理化性质和蛋白质结构,并检测GlyCAM-1基因的组织表达特性。结果表明,绵羊的GlyCAM-1基因CDS区全长465 bp,编码154个氨基酸。测序结果表明,在该基因CDS区检测到7个SNPs,其中2个为同义突变,5个为错义突变。GlyCAM-1二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,延伸链则散布于整个蛋白质结构中。String分析结果表明,GlyCAM-1蛋白与CD34、MadCAM-1都作为L-选择素(L-selectin)的配体发挥作用;RT-qPCR结果表明,GlyCAM-1基因表达具有组织特异性、品种特异性和时空特异性,乳腺、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢和背最长肌8个组织中,GlyCAM-1基因只在乳腺和肺脏组织中表达,在其余6个组织中均不表达,其中乳腺中的表达量最高;在泌乳高峰期的乳腺组织中,GlyCAM-1在高泌乳量的小尾寒羊中的表达量显著高于甘肃高山细毛羊(P<0.05);在小尾寒羊的乳腺组织中,GlyCAM-1在泌乳高峰期的表达量极显著高于空怀期(P<0.01)。本研究结果丰富了绵羊基因组数据,为深入研究GlyCAM-1基因的泌乳生物学功能及其机理提供了基础数据。     

of Goat Follicle-stimulating Hormone Receptor (FSHR) Gene

利用PCR-SSCP技术检测山羊(Capra hircus)包括西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊173个个体FSHR基因第10外显子的单核苷酸多态性 (SNP)。结果未发现SNP位点。测序后获得山羊FSHR基因第10外显子的核苷酸序列， 并在NCBI数据库中获得GenBank登录No.DQ069909和DQ069910。通过DNA序列分析发现， FSHR基因第10外显子第120位碱基不存在C→T的转换，也不存在颠换等其它遗传变化。山羊、绵羊 (Ovisaries L.) 和普通牛( Bos taurus) FSHR基因第10外显子序列同源性比较和聚类分析结果表明，山羊、普通牛和绵羊该部分序列的相似性最高为99.3%；在物种间比较中，绵羊和普通牛纯合子该基因外显子序列的不相似性最高为3.4%；据FSHR基因外显子序列构建的分子系统树结果显示，山羊、绵羊和普通牛物种内的个体各自聚为一类；山羊和绵羊先聚为一类，然后再与普通牛聚为一类。提示FSHR基因第10外显子的核苷酸序列适合于物种间的动物分子树的构建。     

酉州乌羊MC1R基因的克隆鉴定、生物信息学及多态性分析

MC1R是影响皮肤色素沉着中黑皮素系统的重要基因,通过信号分子的相互作用影响黑色素的生成。为探究酉州乌羊 MC1R的生物学特性,本研究对酉州乌羊MC1R进行了分离鉴定、生物信息学分析。结果表明,酉州乌羊皮肤组织MC1R基因的CDS序列为954 bp,共编码317个氨基酸,酉州乌羊与各物种MC1R具有较高同源性。酉州乌羊MC1R编码蛋白的分子式是C₁₆₀₃H₂₅₆₅N₄₁₁O₄₁₀S₂₂,其为疏水蛋白,有7个α-螺旋组成的跨膜结构域和3个保守功能结构域,MC1R氨基酸序列大部分都用于构成α-螺旋。此外,酉州乌羊MC1R基因c.676A>G突变,其编码的氨基酸由赖氨酸转变为谷氨酸,位于受光刺激和G蛋白配体结合的保守结构域上,氨基酸的异义替换还造成了酉州乌羊MC1R空间构象的差异。而对重庆市山羊群体多态性检测发现,山羊MC1R基因c.676A>G变异位点在重庆合川白山羊、巫溪白山羊、本地白山羊、酉州乌羊中共享,且c.676A>G位点的各基因型在皮肤白色和乌色山羊群体中的分布差异不显著(P>0.05)。本研究初步揭示酉州乌羊MC1R的序列特征和蛋白结构,为酉州乌羊MC1R影响皮肤色素沉积的分子机制研究提供了理论数据。     

山羊FSHR基因第10外显子的PCR-SSCP检测及其序列分析

利用PCR-SSCP技术检测山羊(Caprahircus)包括西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊173个个体FSHR基因第10外显子的单核苷酸多态性(SNP)。结果未发现SNP位点。测序后获得山羊FSHR基因第10外显子的核苷酸序列,并在NCBI数据库中获得GenBank登录No.DQ069909和DQ069910。通过DNA序列分析发现,FSHR基因第10外显子第120位碱基不存在C→T的转换,也不存在颠换等其它遗传变化。山羊、绵羊(OvisariesL.)和普通牛(Bostaurus)FSHR基因第10外显子序列同源性比较和聚类分析结果表明,山羊、普通牛和绵羊该部分序列的相似性最高为99.3%;在物种间比较中,绵羊和普通牛纯合子该基因外显子序列的不相似性最高为3.4%;据FSHR基因外显子序列构建的分子系统树结果显示,山羊、绵羊和普通牛物种内的个体各自聚为一类;山羊和绵羊先聚为一类,然后再与普通牛聚为一类。提示FSHR基因第10外显子的核苷酸序列适合于物种间的动物分子树的构建。     

广西德保猪MC1R基因的克隆与分析

近年来含有天然黑色素的动植物黑色食品得到青睐,为探讨广西地方品种德保猪全黑毛色形成的分子机制,本文克隆了广西德保猪MC1R基因并进行了系统生物信息学分析。根据NCBI已公布的猪MC1R基因序列（GI：347618788）设计特异性引物,以从德保猪血液中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆获得长1 519 bp的MC1R基因序列片段。多重序列比较结果显示克隆片段与已公布的猪、牛、人、狗、绵羊、小鼠和鸡的相似性依次分别为99%、87%、86%、85%、84%、81%和77%,表明MC1R基因在不同哺乳动物间具有较高的保守型。德保猪MC1R蛋白结构预测结果显示,其理论分子质量为34.65 ku,等电点为8.70,为弱碱性蛋白,N-末端不存在信号肽,定位于细胞质膜,具有1个低复杂度结构域和7个跨膜结构域,具有典型的细胞膜受体蛋白结构。多项研究报道表明MC1R基因是动物毛皮颜色重要的决定基因,德保猪MC1R基因克隆为揭示其全黑色形成的分子机制奠定了较好的实验基础。