表达dsRNA的转基因烟草能阻止烟草花叶病毒的侵染*

将烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的部分运动蛋白基因(AMP)构建成反向重复结构，插入植物表达载体pBin438上，通过三亲交配法导人根癌农杆菌(Agrobactetqum tumefaciens)菌株EHl05后通过农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacam)品种云烟87，获得了50株转基因烟草。PCR和Southern blot分析表明目标基因已整合到烟草植株的基因组内。用TMV对转基因烟草进行挑战接种，症状观察和病毒浓度的TAS-ELISA检测表明，转基因烟草对TMV的抗性包括3种类型：免疫型占10％；抗病型占4％；感病型占86％。Northern blot分析表明，目标基因mRNA在不同抗病类型植株中的积累量存在明显差异，目标基因mRNA的积累量与抗病性成负相关。     

利用RNA沉默抑制子HC-Pro提高基因表达的策略

利用植物生物反应器生产药用蛋白具有独特的发展优势,但外源基因在受体内会发生基因沉默现象而影响基因的表达。由于基因沉默抑制子能有效抑制外源基因的沉默反应,本研究利用沉默抑制子蚜传辅助因子(helper component-proteinase,HC-Pro)转基因烟草有效提高了外源基因的表达。采用叶片注射法将携带表达载体p35S-30B-GFP的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)重悬液分别侵染野生型烟草(Nicotiana bentamiana)和HC-Pro转基因烟草(N.bentamiana),通过蛋白电泳检测和Western blot检测技术对绿色荧光蛋白(GFP)表达进行比较。研究结果表明,与野生型烟草Nb相比,HC-Pro转基因烟草中GFP的表达水平显著增加。本研究为基因沉默抑制子在植物生物反应器中的应用提供了理论依据。     

利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术快速鉴定两个马铃薯晚疫病抗性相关EST片段EL732276和EL732318的功能

马铃薯晚疫病是由致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)deBary]引起的第一大作物病害,目前已严重限制了全球马铃薯的生产和发展。马铃薯晚疫病抗性分子机理的研究一直是抗病育种中的热点问题。本研究利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术,在本氏烟草(Nicotina benthamiana)中沉默两个马铃薯晚疫病水平抗性相关的基因片段EL732276和EL732318。目的基因沉默后的烟草接种晚疫病菌P.infestans,根据病斑生长速率LGR(length grow rate)来了解这两个基因是否参与烟草对晚疫病的抗性反应。结果表明,目的基因片段EL732276和EL732318被成功地插入烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体中。利用携带八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturae,PDS)的TRV重组载体病毒接种烟草,感染病毒的烟草植株表现光漂白现象,说明VIGS体系有效。用携带目的片段的重组载体病毒TRV:EL732276和TRV:EL732318感染烟草植株,一个月后,烟草叶片接种晚疫病菌P.infestans,从接种P.infestans的烟草叶片上可以看出,感染TRV空载体的对照烟草叶片上病斑扩展速率非常缓慢,而目的片段EL732276和EL732318沉默后的烟草叶片可见明显的水浸状病斑和少量白色的晚疫病菌菌丝。进一步的分析表明TRV:EL732276重组载体病毒侵染的烟草接种P.infestans后LGR值极显著上升,TRV:EL732318病毒侵染的烟草接种P.infestans后LGR值显著上升,表明EL732276和EL732318同源基因在烟草中沉默后,烟草对P.infestans的抗性显著降低。研究结果认为,病毒诱导的基因沉默技术可在本氏烟草中初步快速鉴定马铃薯抗病相关基因的功能。     

利用dsRNA体外饲喂和转基因水稻饲喂抑制褐飞虱相关基因的研究

RNA干涉技术是研究昆虫基因功能的一种有效的方法.通过人工饲料喂养dsRNA(doublestranded RNA)介导RNAi(RNA interference)在包括半翅目在内的许多目昆虫中取得了成功.而通过转基因植株产生dsRNA沉默昆虫基因仅在鳞翅目和鞘翅目中有报道.本研究通过体外合成褐飞虱(Nilaparvata lugens)两个基因(α-1链微管蛋白-ds1和微管蛋白特异的伴侣分子c-ds10)部分区段的同源dsRNA,体外喂食褐飞虱若虫后导致褐飞虱体内目标基因的下降表达和死亡率的增加.本研究同时构建这两个基因的干涉载体转化水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Zhonghua 11),转基因苗喂食褐飞虱若虫后只有食用了个别转基因家系植株的褐飞虱体内目标基因的表达量有所下降,但是均没有导致虫体死亡.本研究中虽然转基因水稻未能导致褐飞虱的死亡,但是利用体外dsRNA喂食能够降低目标基因的表达量甚至导致褐飞虱的死亡,这预示着可以通过技术改进而达到培育抗褐飞虱转基因水稻的可行性,为后续转基因抗褐飞虱水稻的培育提供了依据.     

RPW2表达载体构建及对烟草的遗传转化

将RPW2基因插入表达载体pBI121的表达盒中,构建了RPW2组成型表达载体。通过农杆菌叶盘转化法转化烟草叶片,经卡那霉素筛选、PCR扩增和Southern杂交鉴定证明,RPW2基因已成功转入烟草细胞中,获得6个转基因株系。RT-PCR半定量分析表明,转基因烟草株系的叶片中有RPW2基因的表达。不同转基因株系表达量不同,转基因株系T-R2和T-R4表达量较高。转基因植株叶片上人工接种烟草赤星病菌液检测转基因植株的抗病性,结果表明,与对照植株相比转RPW2基因植株对烟草赤星病抗性显著增强,说明RPW2基因在烟草中也具有抗病能力。另外,转基因株系间RPW2基因表达量虽有差异,但抗病性没有显著差异。     

转PSAG12-BAS1基因抑制烟草叶片的衰老

衰老被认为是烟草(icotiana tabac um)叶片发育的最后阶段,伴随着叶绿素,脂类等降解,严重影响了光合产物的积累,导致作物产量降低、品质下降.因此,利用转基因技术使烟草在生长期间衰老延迟,光合产物量增加,从而增加产量,同时在收获之后,延缓衰老的叶片,可以维持烟草的新鲜程度,解决储存及运输问题.本研究利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化法将含有衰老相关基因12 (senescence-associated gene 12,SAG12)启动子驱动光敏色素B激活标签的抑制蛋白1(phyB activationtagged suppressor1,BAS1)基因表达的元件导入烟草中,经抗性筛选和PCR鉴定,共获得45株转基因植株,其中有8株转基因烟草叶片具有衰老延缓现象.在叶片开始衰老时对野生型和转BAS1基因烟草叶片叶绿素含量、保护酶活性检测以及植物生长期状态进行观察测定,结果表明,转BAS1烟草植株叶绿素含量从顶端到基部均高于野生型;野生型和转BAS1基因烟草超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量分析表明,转BAS1烟草植株中SOD活性比野生型高了31.98％,MDA含量比野生型降低了48.28％,通过对烟草生长发育过程观察,转基因烟草比野生型烟草衰老延缓10～15 d.在烟草叶片开始衰老时测定野生型和转BAS1基因植物细胞分裂素含量,结果发现,野生型烟草细胞分裂素的含量比转基因烟草降低了40.2％,上述结果说明,转BAS1基因延缓了烟草叶片的衰老,与细胞分裂素含量、保护性酶活性提高以及衰老性启动子启动有关.本研究为进一步研究SAG12-BAS1基因功能机制提供理论依据,同时该基因为创制转基因抗衰老材料提供了基础.     

转Barnase基因无籽植物的研究

种子败育的无籽瓜果具有较强的市场竞争力和可观的经济价值.来源于解淀粉芽胞杆菌(Bacillus A myloliquefaciens)的Barnase基因编码12kD的胞外小分子核糖核酸酶(RNAase).在缺乏其天然抑制物Barstar的情况下,单独表达Barnase通常会造成宿主细胞的死亡.本研究用油菜(Brassica napus)种子特异启动子Napin调控Barnase基因,构建T-DNA表达载体,并用叶盘转化法转化烟草(Nicotiana benthamiana),获得55株转基因植株.随机抽取10株对其花器官进行形态学分析,并比较转基因植株和非转基因植株在不同发育时期花器官的形态学变化,发现转基因植株和非转基因植株在授粉前的花器官形态没有明显差异,但是受精以后转基因植株花瓣逐渐枯萎,不能正常发育形成种子,而非转基因植株能够正常形成种子.为了进一步了解转基因烟草种子败育的原因,将转基因植株和非转基因植株正反杂交,均不能正常结籽,表明转基因烟草的种子败育不是由自交不亲和性引起的.将转基因植株和非转基因植株花粉分别使用亚历山大染液染色,显微观察花粉的大小、形状和色泽,发现转基因花粉和非转基因花粉无明显差别,转基因植株和非转基因植株均能产生具有正常授粉活性的花粉.以上研究表明,使用种子特异性启动子驱动Barnase基因表达,外源基因不会通过花粉渗漏表达.本研究成功获得了Barnase基因在种子中特异表达的无籽转基因烟草,该研究为无籽植物的研制提供了一种全新的模式和思路.     

高粱SbSKIP基因的克隆及其在烟草中的抗旱功能分析

SKIP(ski-interacting protein)是一种RNA代谢相关蛋白,在植物抵抗非生物胁迫伤害中起着很重要的调节作用,本研究克隆了高粱(Sorghum bicolor)SbSKIP基因,cDNA编码区全长1 485 bp,编码494个氨基酸;进化树分析表明,高粱SbSKIP基因编码的氨基酸序列与节节麦(Aegilops tauschii)相似性为52％;定量PCR分析表明,在模拟干旱条件下SbSKIP基因表达量上调,在干旱处理16h后,表达量显著增加了2倍以上.构建植物表达载体pSH-SbSKIP,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法遗传转化烟草(Nicotiana tabacum),获得25个转基因植株.选取3个不同株系TP4、TP9和TP13,在不同浓度甘露醇模拟干旱条件下对种子发芽率和幼苗期进行抗旱性分析,结果发现,在300 mmol/L甘露醇处理10d,种子的发芽率比野生型高60％以上,而且从苗期根的生长发现,野生型根的生长明显受到抑制.在自然条件下生长的烟草幼苗,用20％ PEG 6000处理14d,结果显示,转基因烟草正常生长,而野生型烟草大部分叶片黄化甚至出现萎蔫,其中转基因植株超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)的平均活性值比野生型高91.2％,H2O2和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量分别比野生型降低了42％和32.7％,可溶性糖(soluble sugar)含量达野生型的1.1倍.结果表明,SbSKIP基因表达提高了烟草植株的干旱耐受能力.本研究为进一步研究SbSKIP基因功能提供依据,同时该基因的克隆和功能分析可为创制转基因抗旱材料提供基础资料.     

番茄侧根原基发生相关基因RSI-1在烟草中功能的初步研究

为探讨番茄(Lycopersiconesculentumvar.cerasiforme)侧根原基发生相关基因RSI-1在形态发育过程中的作用及其在获得具超量侧根的转基因作物的应用前景,研究分析了RSI-1基因在烟草(Nicotianatabacum)中超量、反义抑制和RNA干扰表达后植株形态及转基因植株内侧根发生相关植物激素含量的变化特征。结果显示,RSI-1超量表达后,植株株高下降,叶片数和分支数有明显增加,而RSI-1反义抑制和RNA干扰表达后植株形态及赤霉素、生长素、脱落酸和玉米素及核苷的含量均没有发生显著变化。推测RSI-1的表达可以促进植物分枝的发生,但其在高等植物中的同源性可能较低,利用该基因定向改造弱根系作物时还需结合根特异启动子的应用。     

马铃薯光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的克隆与功能分析

叶片是植物光合作用器官,在能量固定和利用中具有重要作用,研究光诱导型茎叶特异表达启动子的作用元件及其功能对于其调控基因的表达研究具有重要的理论意义和应用价值。本研究用PCR技术从马铃薯(Solanum tuberosum L.)基因组中分离了光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的1556bp序列,序列分析表明,该片段与已报道的ST-LS1启动子(Gen Bank accession No.X04753.1)有99.68%的同源性,包括参与芽的特定表达和光反应顺式作用元件as-2-box、光效应顺式作用元件G-box等。将该片段与GUS基因融合,构建了植物表达载体pBⅠ121-ST-LS1,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得了转基因植株。用qRT-PCR和GUS活性组织染色检测转基因烟草植株,结果表明,在ST-LS1启动子驱动的GUS转基因烟草植株的叶和茎中能够检测到GUS基因的表达,根中则检测不到;对黑暗、恒温光照培养、自然光条件处理20d后的转基因植株分析表明,在黑暗处理的转基因植株中GUS基因无表达,而在自然光条件处理转基因植株的叶和茎中GUS基因的表达高于恒温光照培养的转基因植株。结果可为应用基因工程改良农作物品种提供理论和应用依据。