秋茄KcRD22基因的克隆与功能分析

本文以用200mmol／LNaCl处理24h后的秋茄幼苗为材料提取秋茄叶片总RNA,利用RT-PCR方法克隆获得KcRD22基因的全长cDNA,通过构建pCAMBIA-2300-KcRD22过表达载体,利用农杆菌侵染的方式获得过表达KcRD22的烟草转基因株系,并对转基因株系的耐盐性做出初步分析。实验结果显示：KcRD22基因的ORF长1131bD,编码1个等电点为9．07、分子量为39．8kD、由375个氨基酸组成的蛋白。PCR及RT—PCR鉴定结果表明,KcRD22基因已经分别整合到8株烟草的染色体中,并在两个株系中获得表达。对转基因烟草进行光合作用测定,结果显示100mmol／LNaC1处理显著降低了野生型烟草的净光合速率,而转基因植株叶片的光合作用受到的影响较小。盐浓度达到200mmol／L时,转基因植株及野生型烟草净光合速率都明显降低,但盐胁迫解除后,转基因烟草光合作用的恢复情况明显好于野生型烟草,说明KcRD22的过表达提高了烟草的抗盐性。本文初步确定了KcRD22基因对植物耐盐性的贡献,这为进一步深入研究该基因在耐盐机制中的功能奠定了良好基础。     

转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析

将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。     

海岛棉 GbRac1基因过量表达提高转基因烟草离体叶片对赤星病的抗性

利用简并引物PCR和3’RACE，克隆了海岛棉(Gossypium barbadense)GbRac1的编码基因。Northern—blot分析表明，海岛棉GbRac1基因在转录水平上受棉花黄萎病菌(Verticillium dehliae)的诱导，诱导后mRNA表达量显著增加。构建组成型植物表达载体pRac，转化烟草(Nicotiana tabacum)品种NC89，离体叶片抗病性鉴定表明，转GbRac1基因烟草对烟草赤星病(Altemaria altemata)的抗性明显提高。这暗示GbRac1在植物抗病基因工程中具有潜在的应用价值。     

一个新的马铃薯patatin classⅠ基因的cDNA在烟草中的表达及其酶活性

将马铃薯(Solanum tuberosum)块茎特异蛋白patatin class Ⅰ基因cDNA与CaMV 35S启动子融合,构建了植物表达载体pBSSP.用电激法将表达载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,然后转化烟草(Nicotiana tabacum)叶片获得再生植株.经PCR、PCR-Southem、Northern杂交和蛋白质检测,证明patatin class Ⅰ基因cDNA已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达.酯酰水解酶(lipid acylhydrolase,LAH)活性分析显示,转基因烟草植株的叶片中LAH活性明显提高.     

表达dsRNA的转基因烟草能阻止烟草花叶病毒的侵染*

将烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的部分运动蛋白基因(AMP)构建成反向重复结构，插入植物表达载体pBin438上，通过三亲交配法导人根癌农杆菌(Agrobactetqum tumefaciens)菌株EHl05后通过农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacam)品种云烟87，获得了50株转基因烟草。PCR和Southern blot分析表明目标基因已整合到烟草植株的基因组内。用TMV对转基因烟草进行挑战接种，症状观察和病毒浓度的TAS-ELISA检测表明，转基因烟草对TMV的抗性包括3种类型：免疫型占10％；抗病型占4％；感病型占86％。Northern blot分析表明，目标基因mRNA在不同抗病类型植株中的积累量存在明显差异，目标基因mRNA的积累量与抗病性成负相关。     

一个新的马铃薯patatin classⅠ基因的cDNA在烟草中的表达及其酶活性

摘要：将马铃薯(Solanum tuberosum )块茎特异蛋白patatin classⅠ基因cDNA与CaMV 35S启动子融合，构建了植物表达载体pBSSP。用电激法将表达载体导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后转化烟草(Nicotiana tabacum )叶片获得再生植株。经PCR、PCR-Southern、Northern杂交和蛋白质检测，证明patatin classⅠ基因cDNA已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。酯酰水解酶（lipid acylhydrolase, LAH）活性分析显示，转基因烟草植株的叶片中LAH活性明显提高。     

PHAs合酶phaC2基因转化烟草叶绿体的研究

中长链羟基脂肪酸聚酯 (medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。Ⅱ型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶。将编码Ⅱ型PHA合酶的基因phaC2与水稻(Oryza sativa )叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建表达盒(RpsbA-pro-phaC2-RpsbA-ter)，连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒(prrn-aadA-TpsbA-ter)一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD中，构建了烟草叶绿体转化表达载体pTC2。基因枪法转化烟草(Nicotiana tobacum L.)叶片，获得具有壮观霉素抗性的转基因烟草。对T0代和T1代转基因植株的PCR和Southern blot鉴定结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中，T1代转基因植株已达同质化。RT-PCR分析结果证实phaC2基因已在转录水平上表达。转基因植株的正反交试验证明外源基因在转基因后代中遵循母性遗传规律，不存在转基因的花粉漂移现象。通过叶绿体遗传转化, 实现中长链羟基脂肪酸聚酯合成关键酶基因phaC2在烟草叶绿体基因组中的稳定转化。     

Ri质粒T-DNA对6年生转基因三倍体毛白杨生长和生理性状的影响

为探索外源基因在成年树木中的表达及稳定性,以转Ri质粒6年生三倍体毛白杨成年树木为材料,以同时种植的未转基因三倍体毛白杨为对照植株,对21个转基因株系和对照植株进行外源基因检测和生长、生理特性测定。PCR检测结果证明,Ri质粒T-DNA上的tms、rolC基因在各转基因株系基因组中稳定存在。转基因株系生长受到不同程度影响,各转基因株系的叶柄长、叶片长、叶片宽度和叶面积均小于对照植株,叶片长宽比大于对照植株;71%的转基因株系树高低于对照植株;81%的转基因株系胸径低于对照植株。转基因株系叶绿素a和叶绿素a+b含量、Fv/Fm值、PI值均低于对照植株。81%的转基因株系叶片内源GA3含量及所有株系叶片的内源IAA含量和IAA/ABA比值均高于对照植株,而86%转基因株系叶片的内源ABA含量低于对照植株。T-DNA能够在三倍体毛白杨成年树木中稳定表达,使植物体内内源IAA和GA3含量提高,生长受到抑制,但不同株系存在较大差异。本研究结果为进一步研究外源基因在植物体内的表达调控机制提供了参考依据。     

转玉米ZmMPK7基因烟草响应高盐胁迫的光合特性和抗氧化酶系统分析

以烟草NC89品种野生株系(WT)和转玉米ZmMPK7基因株系为材料,在NaCl胁迫条件下,对其光合特性和抗氧化酶活性进行分析,以探讨转ZmMPK7基因烟草的耐盐性。结果表明,随盐胁迫加重,转基因烟草植株比野生型具有更高的净光合速率(Pn)、PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）和叶绿素含量（Chl）,并且转ZmMPK7基因株系能提高烟草叶片抗氧化酶活性,诱导抗氧化酶 (SOD、APX、CAT和POD)活性之间协调变化。与野生型相比,转基因烟草植株MDA含量及电解质外渗量较低,膜脂过氧化较轻,其耐盐性得到改善。     

狗蔷薇RaWUS基因组成型表达对烟草叶片形态的影响

为验证从狗蔷薇类原球茎克隆的RaWUS基因的功能,构建了组成型表达载体,并用根瘤农杆菌介导的叶盘转化法对烟草进行了遗传转化。通过除草剂草丁膦筛选,获得了转基因植株并对其进行了表型观察和RT．PCR分析。结果显示转基因烟草叶片形态和叶脉表现出形态变化,包括叶片浅裂、叶片边缘波浪状、叶脉紊乱,甚至叶片的主脉上有不定芽的产生等。RT-PCR分析表明,RaWUS基因仅仅在经过草丁膦筛选的抗性转基因烟草中强烈表达,在野生型烟草中没有表达。表明RaWUS基因已经被成功转入烟草中,并可能通过改变激素的水平和调控维管束的发育来影响叶片形状。     

由根癌农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因转入水稻

摘要:将具有广谱抗病作用的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase , GO）基因插入具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，新构建了水稻高效表达载体pCAG1301。将此质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）菌株LBA4404后,转化粳稻(Oryza. sativa L.ssp.japonica )品种日本晴(Nipponbare)的幼胚，并由筛选出的潮霉素抗性愈伤组织分化再生植株。对所得潮霉素抗性水稻植株的Southern杂交分析表明，GO基因已整合到受体基因组。淀粉-碘化钾显色反应检测到了转基因植株产生的过氧化氢，证实GO基因表达产生的葡萄糖氧化酶已经在水稻中发挥功能。抗病性鉴定表明，所得转基因水稻对稻瘟菌(Magnaporthe grisea )具有良好的抗性。     

水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体的构建及遗传转化研究

为研究水稻热激转录因子基因OsHsfA7的功能及其在水稻耐热育种方面的应用价值,本文通过构建水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体获得功能抑制变异材料,从反向遗传学进行基因的功能分析。扩增OsHsfA7c DNA3'编码区470bp片段,分别以反向和正向插入到中间载体pBSK连接的GUS片段两侧,然后将得到的RNA干扰片段克隆到改造的植物表达载体p1301M,构建以CaMV35S启动子驱动表达的水稻OsHsfA7基因RNA干扰表达载体。将该载体转入根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌介导法进行了水稻日本晴品种的遗传转化,获得了23株具有潮霉素抗性的转基因植株,其中12株经GUS染色呈蓝色并且DNA检测10株已插入目的片段,RNA检测其中6株OsHsfA7基因的表达水平下降甚至未检出。结果说明本研究构建的OsHsfA7基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的。     

转Barnase基因无籽植物的研究

种子败育的无籽瓜果具有较强的市场竞争力和可观的经济价值.来源于解淀粉芽胞杆菌(Bacillus A myloliquefaciens)的Barnase基因编码12kD的胞外小分子核糖核酸酶(RNAase).在缺乏其天然抑制物Barstar的情况下,单独表达Barnase通常会造成宿主细胞的死亡.本研究用油菜(Brassica napus)种子特异启动子Napin调控Barnase基因,构建T-DNA表达载体,并用叶盘转化法转化烟草(Nicotiana benthamiana),获得55株转基因植株.随机抽取10株对其花器官进行形态学分析,并比较转基因植株和非转基因植株在不同发育时期花器官的形态学变化,发现转基因植株和非转基因植株在授粉前的花器官形态没有明显差异,但是受精以后转基因植株花瓣逐渐枯萎,不能正常发育形成种子,而非转基因植株能够正常形成种子.为了进一步了解转基因烟草种子败育的原因,将转基因植株和非转基因植株正反杂交,均不能正常结籽,表明转基因烟草的种子败育不是由自交不亲和性引起的.将转基因植株和非转基因植株花粉分别使用亚历山大染液染色,显微观察花粉的大小、形状和色泽,发现转基因花粉和非转基因花粉无明显差别,转基因植株和非转基因植株均能产生具有正常授粉活性的花粉.以上研究表明,使用种子特异性启动子驱动Barnase基因表达,外源基因不会通过花粉渗漏表达.本研究成功获得了Barnase基因在种子中特异表达的无籽转基因烟草,该研究为无籽植物的研制提供了一种全新的模式和思路.     

乙肝表面抗原基因表达载体的构建及对百脉根的转化

利用PCR成功的从乙肝患者血清中扩增出乙肝表面抗原基因,并构建了含有此基因的植物表达载体pBHB。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法将乙肝表面抗原基因转入百脉根(Lotus corniculatus),从转化植株中提取DNA做PCR检测、Southern杂交,阳性结果验证了目的基因已整合到百脉根的基因组中,转化效率为20%,证实转化的载体真实高效。     

冷诱导基因转录因子CBF1的组成型表达对植物的抗寒性及生长发育的影响

通过农杆菌介导法将玉米泛素启动子(Pubi)调控的CBF1基因以及CaMV35启动子调控的GUS基因一起转化烟草,研究了冷诱导基因的转录因子CBF1(CRT/DRE binding factor 1)对植物抗寒性及生长发育的影响。结果表明:CBF1的组成型表达增强了冷敏感植物的抗寒性;在表型上使植株矮壮,叶片着生密集,叶色深绿,叶厚度增加;促进侧枝生长,延长营养生长期,推迟花期;对植株的结实性无明显影响。植株抗寒能力以及表型变化程度与CBF1的表达强度相关。因此,利用CBF1基因进行植物遗传改良时应根据物种的应用特点采用合适的表达调控策略。     

甘蔗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)转化拟南芥及转基因植株的生理特性分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)是植物糖代谢的主要参与酶之一,在植物的生长发育过程中起着重要作用。本研究将甘蔗(Saccharum officinarum)UGPase基因cDNA片段连接至载体pBI121,通过BamHⅠ和SacⅠ酶切鉴定及测序验证,结果表明,植物表达载体成功构建;通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,采用浸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。结合卡那霉素抗性筛选和PCR检测,获得了5株T0代转基因植株。对T1代转基因植株进行PCR及Southern blot分析,结果表明,目的基因已成功转入拟南芥中,并且不同的转化植株含有目的基因的拷贝数不同。对T2代转基因植株进行PCR和RT-PCR检测,结果表明,目的基因不仅能在自交系后代中稳定遗传,而且在RNA水平也有表达。同时,对T2代转基因植株的可溶性总糖、蔗糖及淀粉含量进行测定,结果表明,与野生型相比,转基因植株中可溶性总糖含量没有明显的变化,但蔗糖含量有所提高,并且差异明显,比野生型植株提高了50.85%~96.99%,而淀粉含量都较野生型植株的低,降低了9.69%~36.76%。说明UGPase在蔗糖与淀粉的转换过程中起着较为重要的作用,其催化的反应方向影响着组织中这两种产物(蔗糖和淀粉)的分配。     

利用RNAi技术提高玉米直链淀粉含量

为了提高玉米直链淀粉含量,用基因枪将前期工作中构建的sbeⅡb RNAi表达载体pBAC413导入玉米自交系幼胚愈伤组织,经过筛选获得了12 株转化再生植株,其中6 个植株获得了结实种子。DNA点杂交、PCR扩增和PCR－Southern均证明目的基因已整合到T0代再生植株玉米基因组中。对T1代转基因玉米籽粒淀粉含量进行测定,结果表明总淀粉含量比对照没有显著变化,其中1个转基因玉米株系的直链淀粉含量比对照提高了15.6%。     

大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶accD亚基表达载体的构建及遗传转化研究

为探索大肠杆菌异质型乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）的β-CT亚基accD基因对油料作物含油量的影响,将目的基因E.coli accD（eaccD）与拟南芥Rubisco小亚基（rbcS）转运肽基因融合,构建以油菜Napin启动子驱动的种子特异表达载体。本试验应用农杆菌介导法,将该表达载体转入油菜,通过PCR检测获得了...     

patatin启动子调控烟草液泡转化酶抑制子在马铃薯抗低温糖化中的作用

为了降低马铃薯(Solanum tuberosum )块茎低温贮藏下还原糖的积累，实验构建了马铃薯块茎特异性启动子（CIPP）调控的烟草液泡转化酶抑制子Nt-VIF基因表达载体pBICNI，并转化马铃薯植株。PCR、Northern杂交和Southern杂交分析结果显示，CIPP调控的Nt-VIF基因全长cDNA成功地导入鄂马铃薯3号（E-3）植株。14个转基因株系块茎分别贮藏在4℃和20℃条件下，贮藏1个月后进行还原糖含量和液泡酸性转化酶（VI）活性测定。结果表明，在20℃条件下转基因株系块茎还原糖（RS）含量与对照相比差异不明显，在4℃条件下RS含量则显著下降，与对照相比下降幅度从34%（株系B-13）至76.8%（株系B-1），说明Nt-VIF cDNA在马铃薯中的表达，成功地抑制了液泡酸性转化酶的活性，导致还原糖含量降低。进一步分析表明，转基因块茎低温贮藏其液泡转化酶活性与还原糖含量呈显著的正直线相关（VI = 0.3084RS + 0.0673）。实验获得的B-1、B-2、B-6、B-9、B-14等5个转基因株系，块茎低温贮藏后能直接满足炸片加工对还原糖含量的要求。