盐生植物海马齿盐胁迫全长cDNA文库的构建与分析

为了研究盐生植物耐盐基因表达调控,本实验以海水浇灌的海马齿植株为供试材料,构建了盐胁迫下的全长cDNA文库。构建方法如下：采用改良的CTAB法提取总RNA,SMART法反转录合成cDNA,LD-PCR方法合成双链cDNA。LD-PCR产物经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后,经CHROMA SPIN＋TE-1000分离柱子除去小片段DNA后,回收0.5kb以上的片段,按照适当的比例连接λTripIEX2载体。连接产物利用MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts进行体外包装,得到海马齿初级cDNA文库。初始文库的独立克隆数为2.4×106pfu,初级文库滴度大于4.80×106pfu/mL,重组率为93.75%,插入片段为0.5～5kb,扩增文库的滴度为1.21×109pfu/mL,所得文库质量较高。本研究表明该cDNA文库适合于盐生植物海马齿相关基因的克隆和分析。     

镉诱导的蚯蚓全长cDNA文库的构建与初步鉴定

采用人工土壤法，研究重金属镉(Cd2+)对成熟赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的急性毒性,表明蚯蚓对镉具有较强的耐受性。Trizol法提取蚯蚓RNA后，采用Clontech公司的CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒，成功构建了低剂量Cd2+（200 mg•kg-1）诱导的蚯蚓cDNA文库，其库容量为3.02×105 pfu/mL,扩增后滴度为8.67×109 pfu/mL，重组率为97.3％, 绝大多数的cDNA插入片段≥0•5 kb,平均长度≈1•0 kb。所够建的cDNA质粒文库容量及插入片段大小符合合格文库要求, 为进一步筛选蚯蚓体内解毒、免疫相关基因，寻找生物标志物奠定了基础。     

环境胁迫诱导的花生全长cDNA文库的构建及序列分析

以花生新品种闽花6号为材料,用生物和非生物因素胁迫处理植株,采用SMART技术构建了花生受低温、干旱、各种激素、缺钙及黄曲霉等胁迫诱导的混合全长cDNA文库,原始文库滴度为8.86×106 cfu,重组率达97.6％,插入片段多在1～2kb之间,平均大小为1 300bp.该cDNA文库的构建可用于花生抗逆基因的发掘,为揭示花生抗逆分子机理及花生品种改良奠定基础.     

外来植物紫茎泽兰入侵对菌根菌群落的影响

为了研究紫茎泽兰(Ageratina adenophora)入侵对土壤菌根真菌(mycorrhizal fungi, MF)群落的影响,采用嵌套PCR 技术分析了外来植物紫茎泽兰入侵生境内土著植物群落、土著植物与紫茎泽兰混生群落、紫茎泽兰单优群落中, 侵染紫茎泽兰及土著植物的MF 群落结构, 及紫茎泽兰与土著植物根围土壤中MF 群落结构。结果表明, 紫茎泽兰不同入侵进程MF 群落结构存在差异, 其中, 从土著植物群落的植物根内检测到内养球囊霉(Glomus intraradices)型克隆; 从土著植物与紫茎泽兰混生群落的紫茎泽兰根内也检测到内养球囊霉型克隆, 而在土著植物根内检测到1 个球囊霉属(Glomus sp 2)型克隆; 从紫茎泽兰单优群落的紫茎泽兰根内未检测到MF, 但从其根围土壤中检测到2 个球囊霉属(Glomus sp 1 和Glomus sp 2)型克隆。在土著植物与紫茎泽兰混生群落中, 从紫茎泽兰根围土壤中检测到4 个克隆型, 分别为毛舌菌阔孢(Trichoglossum hirsutum)、皂味口磨(Tricholoma saponaceum)、亚盖趋本菌(Xylobolus subpileatus)和翘鳞肉齿菌(Sarcodon imbricatus), 从土著植物根围土壤中也检测到4 个克隆型, 分别为小皮伞(Camarophyllopsis hymenocephala)、肉色香蘑(Lepista irina)、皂味口磨及亚侧耳(Panellus serotinus)型克隆; 在土著植物群落中, 从根围土壤只检测到皂味口磨型克隆。紫茎泽兰入侵改变了土著MF 群落结构, 其中在土著植物占据的土壤中以外生菌根真菌为主, 而外来植物紫茎泽兰则更多地积累了丛枝菌根真菌。文中讨论了紫茎泽兰改变入侵地土壤菌根菌群落及其可能对紫茎泽兰入侵的反馈。     

紫茎泽兰群体遗传多样性及遗传结构的AFLP分析

紫茎泽兰是我国最为严重的入侵物种之一。本研究以中国境内的紫茎泽兰为材料，用AFLP方法研究了其群体遗传多样性及遗传分化。用筛选出的3对荧光引物，对5个地区62个群体进行AFLP分析，共扩增出490条带，其中多态性带328条，群体的遗传多样性较高(P = 66.9%，H = 0.171，I = 0.268)，主要存在于群体内，群体间的遗传分化系数Fst为0.287。AMOVA分析表明，在地区水平紫茎泽兰的遗传分化主要存地区内，群体内遗传分化占 70.25%，群体间遗传分化占21.71%，地区间的遗传分化仅占8.04%。UPGMA聚类分析结果表明，62个地理群体主要分为四大类群，并且有明显的地缘关系。Sigmaplot分析表明海拔是影响紫茎泽兰遗传多样性主要地理因子。Mantel检验表明遗传距离与地理距离成正相关(r = 0.34)，但也有例外。由此推断风媒传播可能是紫茎泽兰的主要传播方式，水媒传播可能是紫茎泽兰的另一主要传播途径；随着紫茎泽向东、向北扩散，新入侵地区的遗传多样性逐步降低。     

华东葡萄白河-35-1株系抗霜霉病基因cDNA文库构建及EST分析

以中国原产抗霜霉病葡萄野生种华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）白河-35-1为材料,用SMARTTM技术构建葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）诱导的葡萄叶片cDNA文库。经检测,原始文库滴度0.92×106 pfu/mL,重组率97%,插入片段500～2 200 bp,扩增文库滴度为5×109 pfu/mL。随机挑取克隆5'端测序,获得254条有效EST序列（GenBank登录号：FG269201~FG269449和FG396006~FG396010）。经BlastX分析,有56.3% ESTs与GenBank中功能已知基因有较高同源性,14.6%ESTs与功能尚未确定的假设蛋白或未知蛋白同源性很高,20.9%ESTs在GenBank中无匹配的同源产物。     

稻瘟病菌发育cDNA文库构建与表达序列标签分析*

利用稻瘟病菌(Magnaporthegriesa)连续6个发育时期的材料构建了一个混合cDNA文库。文库滴度,重组率和插入片段长度等质量分析表明,构建的文库包含完整的稻瘟病菌基因,可用于病菌基因表达分析。利用该文库获得了7456条5′端表达序列标签(ESTs)(GenBank收录号:(CK909944￣CK913666和CK928583￣CK932582),生物信息分析表明:EST序列拼接出2975个假定独立转录本(TUTs),冗余度为60.1%;从cDNA文库中筛选出大量的低丰度表达基因,约占TUT总数的79.8%,说明在文库中基因组成类型的复杂性较高;在所有TUTs中,功能未知基因约占85.5%,编码ECM33蛋白和疏水蛋白等病菌致病相关的注释基因高丰度表达,进一步表明该cDNA文库反映了病菌侵染和发育过程中基因表达的状况。     

土壤微生物对紫茎泽兰生长与竞争的反馈: 不同灭菌方法的比较

土壤微生物去除是验证土壤微生物反馈调节入侵植物竞争排斥本地植物群落的重要手段。为了确定土壤微生物反馈效应的最佳土壤微生物去除方法,以及土壤微生物对紫茎泽兰与本地植物竞争中的反馈作用,本试验比较了添加蛭石和未添加蛭石下,3种常见土壤微生物灭菌方式(干热灭菌、湿热灭菌、辐照灭菌)处理的紫茎泽兰单优群落根际土壤对紫茎泽兰与本地植物香茶菜生长的影响。结果表明:与未灭菌处理土壤相比,3种灭菌处理土壤均显著抑制了紫茎泽兰和香茶菜的生长;添加蛭石灭菌的土壤相对于未添加蛭石的灭菌土壤显著促进了2种植物的生长;灭菌土壤添加蛭石的情况下辐照灭菌土壤的两种植物的生物量显著地高于干热灭菌和湿热灭菌土壤两种植物的生物量,其中辐照灭菌下紫茎泽兰的生物量分别比干热灭菌和湿热灭菌条件下增加30.8%和66.5%,香茶菜生物量分别显著增加109.5%和63.4%。辐照灭菌土壤添加蛭石的处理方式最接近真实地反映土壤微生物对植物生长的反馈效应。进一步进行辐照灭菌土壤添加蛭石处理与未灭菌土壤添加蛭石处理的紫茎泽兰与香茶菜混种的盆栽试验,结果显示,土壤微生物显著增强了紫茎泽兰对香茶菜的竞争优势,相对竞争优势度增加16.0%,说明土壤微生物在紫茎泽兰竞争排斥本地植物的入侵过程中具有正反馈偏利调节作用     

洪水对紫茎泽兰入侵繁殖的影响

紫茎泽兰是我国危害最严重的外来入侵植物之一。对四川省宜宾市境内金沙江岸边一个极特殊的人工建筑内的紫茎泽兰进行了调查，发现调查区域内紫茎泽兰同时以有性和无性两种方式繁殖。紫茎泽兰植株的空间分布特征表明，风、人类活动、交通运输等在其他区域对紫茎泽兰入侵影响较大的因素，对该区域内的紫茎泽兰入侵无明显影响；种种迹象表明，洪水是该区域紫茎泽兰繁殖体最重要的来源，即洪水是紫茎泽兰入侵的重要促进因素。最后，根据金沙江流域水土流失严重和紫茎泽兰在该流域大面积分布的特点，探讨了洪水对紫茎泽兰扩散入侵的影响。     

构建脱水反应元件(DRE)报告子用于小叶杨DRE转录因子的克隆

通过基因合成构建了脱水反应元件(dehydration-responsive element,DRE)酵母表达载体,通过同源重组,利用SD-His-Ura平皿筛选获得了含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE双重报告子的酵母即得DRE报告子。建立小叶杨(Populus simonii)干旱模型,提取RNA,构建小叶杨cDNA AD融合表达文库,通过酵母单杂交的方法,用DRE报告子对小叶杨cDNAAD融合表达文库进行了筛选,得到了2个阳性克隆。结果表明,所构建的DER报告子被激活,可用于小叶杨DER转录因子的克隆。     

海岛棉纤维均一化酵母双杂交文库的构建与GbTCP5互作蛋白的筛选

为探究转录因子在海岛棉纤维中的生物学功能,以海岛棉8个时期的纤维为研究对象,利用SMART技术合成ds-cDNA,经DSN进行均一化处理,构建以pGADT7为载体的海岛棉纤维均一化酵母cDNA文库,利用酵母双杂交系统筛选与海岛棉GbTCP5互作的蛋白。根据克隆得到的GbTCP5基因的CDS区设计含有NcoⅠ、EcoRI酶切位点的引物,构建诱饵载体pGBKT7- GbTCP5。经自激活和毒性检测后共转化酵母菌株Y2HGold,筛选与GbTCP5互作的蛋白。实时荧光定量PCR显示,GbTCP5基因在纤维发育起始期和伸长期的表达量较高,且在花瓣和花萼中的表达量高于其他组织。文库的质量检测显示,构建的均一化cDNA文库库容为9.15×10⁷ cfu·mL^-1,重组率为100%,插入片段大小在500~2 000 bp之间。诱饵载体pGBKT7-GbTCP5通过酵母双杂交系统多次筛选、回转验证,最终确定了4个互作的蛋白,分别是GbTCP20、GbTCP42、GbTCP45和GbAHP1蛋白。海岛棉纤维均一化cDNA文库的构建和筛选,为进一步研究海岛棉TCP转录因子及其互作蛋白在纤维发育时期中的作用机制奠定了基础。     

花生油体蛋白家族基因的克隆和表达分析

油体蛋白是一类覆盖在油体表面的碱性小分子蛋白.油体蛋白的存在对于维护油体的稳定性非常重要,油体蛋白也是种子作为生物反应器表达重组外源蛋白的重要载体.本研究通过构建花生(A rac his hypogaea L.)未成熟种子的全长cDNA文库,测序得到284条编码油体蛋白的EST.根据编码蛋白分子量的大小可将花生油体蛋白基因分为6个亚族:AhOLE O- 16.9、AhOLEO- 17.7、AhOLEO- 18.6、AhOLEO-22、AhOLEO- 18.4和AhOLEO- 14.3 (GenBank登录号分别为:EG372527、EG373122、EG373716、EG372719、EE125019和EE124234),其中AhOLEO- 16.9,AhOLEO- 17.7和AhOLEO- 14.3分别有2个成员,其它家族的各只有1个成员.本研究首次从花生中克隆了分子较大的AhOLEO-22.cDNA芯片和半定量PCR结果表明6个亚族的油体蛋白基因在花生的不同器官和在种子不同发育时期表达模式相似,在根、茎、叶、花中几乎检测不到油体蛋白基因的表达,在种子中表达量高,在果针入土15d内几乎检测不到油体蛋白基因的表达,随着种子发育成熟油体蛋白基因的表达量逐步提高.本研究为研究花生油体蛋白基因的家族构成和利用花生油体蛋白基因提高花生含油量、生产外源蛋白等提供了有用的信息.     

陆地棉酵母双杂交cDNA文库及VdSCP7诱饵载体的构建

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是制约我国棉花生产的首要病害,严重影响棉花的产量与品质。为研究棉花与黄萎病菌互作的分子机制,本研究以国审棉百棉1号为材料,提取被大丽轮枝菌侵染的棉花根部总RNA,检测质量并用DNase Ⅰ处理后,用RNA 5'末端的模板转换方法,即SMART技术合成双链cDNA,再经酶切、过柱纯化去除短片段后,连接至pGADT7载体上构建棉花cDNA文库。VdSCP7是定位于寄主细胞核的大丽轮枝菌效应因子,能激发棉花的免疫反应,增强棉花抗病性。以大丽轮枝菌cDNA为模板扩增VdSCP7,产物纯化后重组到载体pGBKT7上构建诱饵载体pGBKT7-SCP7。诱饵载体经酶切及测序鉴定后,转化到酵母AH109中,鉴定诱饵蛋白毒性并检测诱饵载体是否存在自激活活性。结果表明,获得了库容量为2×10⁶ CFU的棉花cDNA文库,文库片段多样性良好,文库重组率约94%,质粒文库滴度约2.0×10⁹ CFU·mL^-1,满足酵母双杂交cDNA文库构建要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pGBKT7-SCP7构建成功且经过鉴定后无毒性、无自激活活性。本研究结果为棉花抗黄萎病基因的筛选及VdSCP7和棉花互作机制的解析奠定了基础。     

小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析

以成株期抗条锈小麦(Triticum aestivum)品种兴资9104为材料,依照CLONTECH公司PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit方法构建了小麦成株期条锈菌(Puccinia striiformis)诱导的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库。建库质量分析表明,接头连接效率高,插入片段平均300bp,文库质量较好。对文库中随机挑取的96个阳性克隆进行测序,用CAP3软件聚类拼接,得到unigenes41个。与GenBank已知序列进行Blastx分析表明,所得基因主要涉及植物的信号传导、转录调控、能量与代谢、蛋白质合成与代谢、膜转运、细胞生长分化等。利用RT-PCR对3条基因进行分析,明确其在抗病过程中的表达模式。     

陆地棉GhLipase基因的克隆、特征分析及定位

利用已构建陆地棉7235纤维cDNA文库测序, 结合5′RACE技术从陆地棉 (Gossypium hirsutum L) 7235纤维中获得了1个1 286 bp的cDNA。序列分析结果表明, 该cDNA 包含一个编码368个氨基酸的开放读码框, 5′非翻译区和一个带有Poly (A) 的3′非翻译区区域。与已报道的其它植物的脂肪酶基因具有较高的氨基酸序列同源性, 命名为GhLipase,提交到GenBank, 登录号为EU273298。RT-PCR分析表明, GhLipase在棉花的胚珠及纤维细胞中优势表达。Southern blot分析结果表明, GhLipase在陆地棉基因组可能存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A13染色体上。