插入序列ISRso21在青枯雷尔氏菌中的分布以及插入位点多态性分析

插入序列(insertion sequence,IS)元件可以插入到基因或DNA序列,其可能在生物体进化中起着重要的作用。ISRso21是在青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)FJAT-1458菌株中发现的一个新的插入序列。根据序列分析可知,该插入序列是属于ISL3家族中的一个成员。本研究发现,福建闽北地区菌株ISRso21的阳性率高于其他地区的趋势,不同地区的青枯雷尔氏菌ISRso21的分布有显著性差异,ISRso21的分布可能与菌株分离个体的地理来源有关。不仅如此,由于ISRso21在青枯雷尔氏菌插入位点的不同,从而导致青枯雷尔氏菌致病性的差异。研究表明,由于ISRso21的插入导致表现型转换系统转录调控因子A(phc A)的重排可能在青枯雷尔氏菌的致病性起着极其重要的作用。在所有菌株中,ISRso21在phc A基因上游中插入的检出率达到4.71%,其中无致病力菌株和强致病力菌株中的检出率分别为28.57%和0.00%。而ISRso21在二氨基庚二酸脱羧酶基因中的插入可能是为了更好地适应环境。ISRso21在不同致病性青枯雷尔氏菌中的插入位点的研究,可能为揭示青枯雷尔氏菌致病性机制提供新的研究途径。     

福建省青枯雷尔氏菌无毒基因组成及与致病力关系分析

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化严重.为了解福建省青枯雷尔雷氏菌的致病力类型及与无毒基因组成关系,本研究以弱化指数为指标,对福建省内不同地区和寄主的63个青枯雷尔氏菌进行致病力测定,结果表明,供试的青枯雷尔氏菌可分为3种致病力类型:强致病力、过渡型和无致病力;进一步对供试菌株进行无毒基因avrA、popP1和popP2的检测,3个无毒基因分布频率不同,avrA基因分布频率最高,达79.37％,popP1基因的分布频率最低为46.03％;不同寄主的菌株无毒基因组成不同,番茄(Lycopersicum esculentum)和辣椒(Capsicum annuum)寄主以分布3种和2种无毒基因为主,茄子(Solanum melongena)寄主主要分布2种无毒基因,花生(Arachis hypogaea)寄主的菌株无毒基因分布较少,只分布1种avrA基因或没有检测到无毒基因;不同地域的菌株无毒基因组成不同,以番茄寄主为例,建瓯玉山镇的菌株分布3种和2种无毒基因为主,分别占45.45％和31.82％,宁德屏南菌株中3个无毒基因均等分布,福州北峰菌株中只分布avrA和popP2基因,二者均等分布,福州营口菌株中popP2基因分布频率最高,达60.00％;不同致病力的菌株无毒基因组成不同,无致病力菌株分布3种和2种无毒基因为主,过渡型菌株分布2种无毒基因为主,而强致病力菌株分布1种无毒基因为主;青枯雷尔氏菌的无毒基因组成与致病力相关性分析表明,3个无毒基因分布均与致病力呈正相关,其中popP1基因与菌株致病力相关性最高,达显著水平,其皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient,PCC)值为0.31.本研究为植物青枯病预警和防控提供重要信息.     

基于BOX-PCR和REP-PCR技术青枯雷尔氏菌遗传多样性分析

青枯雷尔氏菌(Ralstonias olanace arum)能够对许多重要作物引起致命性萎蔫病害,广泛分布在热带、亚热带以及温带地区.研究青枯雷尔氏菌的遗传多样性对于了解青枯病的发生和流行具有十分重要的意义.本研究利用青枯雷尔氏菌特异性引物鉴定84株来自福建地区不同寄主的青枯雷尔氏菌,结果表明,这些菌株均在504 bp位置出现特异性条带.同时采用BOX插入因子PCR(BOX-PCR)和重复基因外回文序列PCR(REP-PCR)对这些菌株进行基因多样性研究,基于它们所扩增出的基因指纹图谱表明,BOX-PCR扩增出19条特异性条带,REP-PCR扩增出20条特异性条带.系统聚类结果表明,青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性,其中,寄主植物是在遗传差异中起主导作用.进一步分析可知,地域性的差异主要由BOX-PCR提供,寄主间的差异主要由REP-PCR提供.不同地理来源的青枯雷尔氏菌在BOX-PCR中可扩增出各自特异性条带,在REP-PCR中同样具有与各个寄主相对应的特异性条带,利用这些特异性条带可以很容易区分不同寄主以及来源的青枯雷尔氏菌.BOX-PCR和REP-PCR多态性分析技术可为我国青枯雷尔氏菌基因多样性的研究提供另一条途径.     

基于ITS序列和RAMS标记分析青枯雷尔氏菌的遗传多样性*

应用ITS序列和RAMS技术对福建省不同地域,不同寄主作物的青枯雷尔氏菌进行遗传多样性研究。结果表明,供试的21株青枯雷尔氏菌的ITS区序列有3种类型,这3种类型菌株的ITS序列只有1-2个碱基的差异,与参比菌株GMI1000的ITS区序列或者相同或者有1-2个碱基的差异。在此基础上,利用RAMS技术进一步分析表明,供试的青枯雷尔氏菌及参比菌株GMI1000的基因组DNA间存在丰富的多态性。聚类结果显示,供试菌株可聚为3个类群,同一寄主作物的菌株聚在同一类群中,同一地理来源的菌株聚在同一亚类群中,说明青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性,与寄主作物的关系更密切。     

生防菌对青枯雷尔氏菌的致弱特性

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的致病性与弱化指数存在着特定的相关性,弱化指数＜0.60时,菌株回接番茄组织培养苗的发病率为100%,定义为强致病力菌株;弱化指数＞0.80,回接发病率为0,定义为无致病力菌株,弱化指数介于0.60和0.80之间,回接发病率5.3%～100%,菌株的致病性为不确定性,定义为过度性菌株.010703-01菌株进行培养致弱、物理致弱、化学致弱和生物致弱的实验结果表明培养时间延长至120 h未发现致弱作用继代培养11代以前未出现明显致弱;物理因子超声波处理无致弱作用;化学因子农用链霉素处理有抑制作用,但无致弱作用;生物因子15种细菌的致弱作用可用聚类分析将之分为三类,第一类具致弱特性,包括青枯病生防菌ANTI-8098A(Bacillus cereus)和球形芽孢杆菌(B.sphaercus),第二类具抑制特性,而无致弱作用,包括Bt-9408(B.thuringiensis)等3种芽孢杆菌;第三类抑制作用低和无致弱作用,包括阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)和未知学名的10株芽孢杆菌(Bacillus spp.)等.研究结果表明,生防菌对青枯雷尔氏菌的致弱作用与因其它因素产生的致弱作用有着本质区别.     

植物青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性的测定

根据青枯菌(Ralstonia solanacearum)与群体猝灭相关aac基因序列设计PCR引物,扩增获得了aac基因,并将基因克隆到pGEM-T- easy载体中。将庆大霉素基因插入aac基因内部,使其突变,将含有庆大霉素基因的aac突变基因亚克隆进入自杀质粒pDS132中,构建成aac基因重组自杀质粒pDS-aac’-Gm。将自杀质粒电转化至青枯菌GMI 1000菌株中,通过体内同源重组,置换其野生型的aac基因。通过三步筛选法和PCR扩增鉴定,筛选获得了具有庆大霉素抗性的青枯菌aac基因突变株(GMI 1000-m)。接种番茄结果显示,青枯菌aac突变株的致病性较野生型GMI 1000明显下降。证明aac基因在青枯菌致病过程中具有重要作用。     

生物有机肥对烟草根际微生物群落及青枯雷尔氏菌丰度的影响

【目的】探究生物有机肥施用对烟草根际土壤细菌、真菌群落结构和青枯雷尔氏菌丰度的影响机理。【方法】选用长沙市某公司生产的生物有机肥和常规烟草专用肥,在湘西花垣县长期定位试验点连续5年开展大田试验,研究施肥对土壤理化性质和微生物群落的影响。试验设置两种施肥处理：常规烟草专用肥（CF）和生物有机肥（BOF）。【结果】与CF相比,施用生物有机肥处理的土壤烟草青枯病发病率降低了89.8%,同时青枯雷尔氏菌相对丰度也显著降低,降幅达40.1%;土壤pH、碱解氮和有效磷显著增加,分别增加了1.2%、12.1%和60.2%;施用生物有机肥后根际土壤微生物如Roseiflexaceae,Gemmatimonadaceae,Nitrospira,Ramophialophora,Preussia等显著富集,且这些潜在有益菌与青枯雷尔氏菌相对丰度呈显著负相关关系。通过ABT预测模型分析发现潜在有益菌是影响青枯雷尔氏菌相对丰度的最主要生物因子。【结论】连续5年的试验结果表明,施用生物有机肥不仅改善了作物生长的土壤环境,显著提高了土壤pH和土壤速效养分含量,还促使潜在有益菌在根际土壤中富集,抑制了青枯雷尔氏菌的生...     

青枯无致病力菌株对烟草青枯病控病研究及机理初探

本实验以无致病力青枯菌为材料,针对烟草青枯病进行了控病及机理的初步研究。结果显示,温室控病中各菌株伤根接种相对防效高于灌根接种,Aujd5-2y温室控病相对防效为80.49%,其田间相对防效高于农用链霉素,其抗药性突变株在烟草根表和体内可短暂定殖。Au004-1、Tmjd1-3可诱导烟草产生抗病性生理生化变化,表现为PAL、POD、PPO活性增加,病程相关蛋白量的积累。     

应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因

植物青枯菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化菌株 Po82 兼具 2 号小种和 NPB(非香蕉致病)菌株的致病特征。为了研究该菌株致病力分化机理,本实验以 Po82 为待测菌株,构建了抑制性差减杂交文库。建库质量分析结果表明,具有较高的接头连接以及文库构建效率,插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序,共筛选出 44 个 Po82 菌株差异基因。生物信息学分析结果表明,所得差异基因主要涉及新陈代谢、转座酶、膜结构、分泌蛋白、毒力、转录因子以及未知功能等。利用基因敲除技术对其中的 c00283 基因功能进行了研究,结果表明,该基因在 Po82 菌株致病过程中起重要作用。半定量 RT-PCR 结果表明,c00283 基因在 hrp 诱导培养基中的表达情况与 hrpB 基因一致,初步确定其为Ⅲ型分泌系统效应子。基础生物学实验结果表明,该基因对 Po82 菌株的生长、生物膜形成及运动性没有影响。青枯菌 Po82 菌株抑制性差减杂交文库的构建及致病相关基因的功能分析,为后续致病力分化的分子机理研究提供基础材料。     

用荧光假单孢菌防治番茄青枯病

土壤中存在着大量对植物病原菌有拮抗作用的细菌。据报道，番茄青枯病菌的拮抗菌占土壤细菌的６．５％－２８．６％。通过分析研究，番茄青枯病菌的拮抗菌多数属于荧光假单孢菌属。经多次分离筛选，从土壤中分离出了对作物无不良影响而对番茄青枯病菌有拮抗作用的菌株１０４个。经试验，利用这种拮抗菌防治番茄青枯病，当发病株率在２５％以下时，防治效果可达１００％；但当发病株率达４５％时，防治效果仅为５０％左右。这表明，利     

作物轮作对土壤中烟草青枯菌数量及发病的影响

为查明春烟换茬后青枯菌在土壤中的消长规律, 采用接种耐药性青枯菌的盆土种植烟草, 烟草枯死后种植不同轮作作物的方法, 研究不同作物对土壤中青枯菌数量及其越冬状况的影响。设茄子、大豆、花生、甘薯、大蒜、玉米、晚稻和双季稻8 个轮作物处理, 后作生长期间定期取样, 用含利福平的选择性培养基检测样品中的青枯菌数量。结果表明, 栽后第4 周起秋茄子和秋大豆根中皆测出青枯菌, 秋茄子根达10⁶ cfu·g^-1;晚稻和秋花生根只第2 周和第8 周测出带菌。秋茄子、秋大豆、秋花生和晚甘薯生长期间土壤皆测出青枯菌,数量先降后升至10⁴~10⁶ cfu·g^-1; 晚稻和秋玉米土壤中青枯菌数量持续下降; 大蒜处理先测出带菌后未测到。冬季对水稻残桩青枯菌数量监测显示, 稻桩根和土壤中青枯菌数量先后出现峰值, 分别达1.00×10⁵ cfu·g^-1 和5.17×10⁴ cfu·g^-1; 发现病菌能在稻根变黑腐烂时增殖。翌年春季从茄子、大豆、花生和甘薯茬口土壤中测出遗留青枯菌数量皆达10⁴ cfu·g^-1, 玉米为10³ cfu·g^-1。烟草移栽后青枯病调查表明, 不同处理发病迟早取决于茬口土壤中菌源数量, 两者相关系数r 为0.908 9。不同茬口土壤发病轻重有显著差异, 茄子茬土发病最重,病情指数100, 大豆和大蒜茬土发病略重于花生、甘薯和玉米茬土; 晚稻茬土发病最轻, 病情指数16.7, 与茄子茬土相比发病期推迟20 d, 病情指数下降83.3%; 双季稻茬土未见发病, 证明烟稻轮作对青枯病有较好的控制效果。     

青枯菌II型分泌系统编码基因的克隆

植物青枯菌II型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关。编码青枯菌II型分泌系统的gsp基因簇由12个基因组成,我们通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系,成功克隆了编码青枯菌II型分泌系统的全部12个gsp基因。分别将gsp基因连接到酵母双杂交系统的诱饵及捕获载体上,构建了gsp基因诱饵库和捕获库。经序列测定证明12个gsp基因读框正确,保障了其在酵母系统中的表达,为GSP蛋白之间的互作研究奠定了基础     

Identification of genetic loci in a rhizosphere-inhabiting,species of Pseudomonas involved in expression of a phytoparasitic nematode ovicidal factor

Pseudomonas sp. BG33R was isolated from peach orchard soil suppressive to the phytoparasitic ring nematode, Mesocriconema xenoplax. Tn5 transposon mutagenesis was utilized to generate five BG33R mutants 246, 1122, 1233, 1397, and 1917, which lacked ovicidal activity and also exhibited altered fluorescent siderophore and protease production. Southern blot analysis revealed that each of the five mutants contained a single unique Tn5 insertion. Mobilization of selected BG33R genomic cosmid clones into mutants 246 and 1917 restored egg-kill activity and restored normal protease and siderophore production. Furthermore, a genomic cosmid clone hybridizing to the Tn5 insertion site in 1122 also complemented mutant 1917. Site-directed mutagenesis of BG33R using the cloned Tn5 insertion site from mutant 1397 resulted in the loss of ovicidal activity and restoration of the hyperfluorescence phenotype. Sequence analysis was performed on the genetic regions flanking the Tn5 insertion site in all five egg-kill-negative mutants. Open reading frame analysis and amino acid comparative database searches of the Tn5 insertion sites in the five mutants revealed a high degree of homology to the vgrG gene, the two-component sensor kinase protein, rtpA (gacS analog), a UDP-glucose 4-epimerase gene, a siderophore receptor protein, and the 50S ribosomal protein, L21. The involvement of these genes in the production of the egg-kill factor is discussed.     

抗福美双假单胞菌株的NTG化学诱变及分子探针鉴定

利用微生物的抗药性筛选抗福美双的假单胞菌株Ｔ４６，然后通过亚硝基胍（ＮＴＧ）化学诱变获得了对福美双敏感的三株突变株Ｔ４６Ｎ１０、Ｔ４６Ｎ７和Ｔ４６Ｎ１７。利用这三个突变株作受体，通过基因克隆的方法筛选到了可使三个突变株恢复抗性的克隆，抗性基因分别被定位在７ｋｂ、２．５ｋｂ和２０ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ片段上。将这三个克隆分别用（３２）Ｐ标记后制成分子探针，然后分别与三个突变菌株的总ＤＮＡ进行ＤＮＡ－ＤＮＡ分子杂交，结果表明，各突变株均存在与菌株Ｔ４６的抗福美双基因克隆的高度同源性，经结合形态、生理生化等分析后证实这三株突变株均源自于出发菌株Ｔ４６。     

ATR-FTIR技术在小麦籽粒识别上的探索

为探索衰减全反射傅里叶变换红外光谱技术(ATR-FTIR)在小麦籽粒品种(系)识别和籽粒性状突变体鉴别上的应用,本研究采集了91个小麦品种(系)和576个小麦M₅突变体及235个对照株系籽粒的ATR-FTIR光谱,其中71个小麦品种(系)用于建立小麦籽粒ATR-FTIR识别模型,20个小麦品种(系)用于外部验证;对建模光谱数据进行7种预处理,在3 600~1 000 cm^-1波段内建立小麦籽粒品种(系)识别模型,外部验证检验该模型的准确性;并应用该模型从M₅突变株系中鉴定籽粒性状突变体。结果表明,使用多元散射矫正+Norris平滑(MSC+ND)预处理方法建立的小麦籽粒ATR-FTIR识别模型能完全鉴别71个小麦品种(系)的籽粒,且外部验证也证实了该模型的准确性;应用建立的小麦籽粒ATR-FTIR识别模型,从突变株系中鉴定了4个籽粒性状潜在突变体,突变率为0.69%。本研究建立了小麦籽粒ATR-FTIR识别模型,实现了对不同小麦品种(系)籽粒的区分,并将该模型应用于突变体鉴别,拓宽了ATR-FTIR光谱技术在小麦上的应用领域,同时为筛选小麦籽粒性状突变体提供了新的途径。     

大黄欧文氏菌蔗糖异构酶控制产物特异性基序的定点突变

大黄欧文氏菌（Erwinia rhapontici）蔗糖异构酶催化蔗糖异构为异麦芽酮糖和海藻酮糖,具有一个可能控制产物特异性的325RLDRD329基序。本研究以定点突变方法对该基序的带电荷氨基酸进行突变,共构建R325D、R328A、R328D、R328Q和D329N5个突变体。通过对突变体的酶学特性及突变体转化蔗糖的产物组成分析,结果显示所构建突变体的Km值上升约2～5倍,比活力下降至野生型SI比活力的11.8%～25.3%。HPLC分析显示Arg325和Arg328分别突变为Asp,导致产物中异麦芽酮糖/海藻酮糖的比例从6.93分别降至0.96和2.92,并伴随一个未知寡糖出现。Arg328突变为Ala和Gln同样导致反应产物中海藻酮糖比例上升,异麦芽酮糖比例下降。但是突变体D329N反应产物比例没有变化。以上结果表明325RLDRD329基序对大黄欧文氏菌蔗糖异构酶的酶活具有重要作用,并对酶的产物特异性产生影响。本研究结果将为该酶的作用机理研究奠定基础。