青枯菌Ⅱ型分泌系统编码基因的克隆

植物青枯菌Ⅱ型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关.编码青枯菌(Ralstonia solanacearum)Ⅱ型分泌系统的gsp基因簇由12个基因组成,通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系,成功克隆了编码青枯菌Ⅱ型分泌系统的全部12个gsp基因.分别将gsp基因连接到酵母双杂交系统的诱饵及捕获载体上,构建了gsp基因诱饵库和捕获库.经序列测定证明12个gsp基因读框正确,保障了其在酵母系统中的表达.     

马铃薯AP1抗病传导链中蛋白元件的鉴定

酵母双杂交系统的建立为在体外研究蛋白质问的相互作用提供了可能，在验证植物与病原物相互识别过程中是否发生蛋白质与蛋白质的互作及研究植物抗病信号传递链中发挥了不可替代的重要作用。本研究以马铃薯抗病蛋白API编码基因为诱饵，从cDNA文库中捕获与API发生互作的蛋白，研究围绕API蛋白的与抗病有关信号传导途径。     

番茄SlPSY1基因转录调控因子筛选及互作验证

番茄八氢番茄红素合成酶(SlPSY1)作为类胡萝卜素生物合成途径的关键限速酶,直接影响果实中类胡萝卜素的积累。为探究SlPSY1基因的转录调控机制,通过克隆SlPSY1基因启动子序列,构建pSlPSY1pro-AbAi诱饵载体,并将诱饵载体转化至酵母细胞中获得诱饵酵母菌株。利用番茄混合组织酵母杂交cDNA文库进行酵母单杂交筛库试验,筛选得到AP2/ERF家族转录因子SlJERF1和10个未知功能蛋白。后续克隆SlJERF1基因序列,构建pGADT7-SlJERF1重组载体,通过酵母单杂交点对点对SlJERF1进行分子验证,结果显示在金担子素(AbA)浓度为150 ng·mL^-1的条件下,对照组酵母不能正常生长,而试验组酵母能正常生长,表明SlJERF1与SlPSY1基因启动子存在互作。这一结果为进一步拓展类胡萝卜素合成调控网络提供了重要的理论依据。     

应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因

植物青枯菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化菌株 Po82 兼具 2 号小种和 NPB(非香蕉致病)菌株的致病特征。为了研究该菌株致病力分化机理,本实验以 Po82 为待测菌株,构建了抑制性差减杂交文库。建库质量分析结果表明,具有较高的接头连接以及文库构建效率,插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序,共筛选出 44 个 Po82 菌株差异基因。生物信息学分析结果表明,所得差异基因主要涉及新陈代谢、转座酶、膜结构、分泌蛋白、毒力、转录因子以及未知功能等。利用基因敲除技术对其中的 c00283 基因功能进行了研究,结果表明,该基因在 Po82 菌株致病过程中起重要作用。半定量 RT-PCR 结果表明,c00283 基因在 hrp 诱导培养基中的表达情况与 hrpB 基因一致,初步确定其为Ⅲ型分泌系统效应子。基础生物学实验结果表明,该基因对 Po82 菌株的生长、生物膜形成及运动性没有影响。青枯菌 Po82 菌株抑制性差减杂交文库的构建及致病相关基因的功能分析,为后续致病力分化的分子机理研究提供基础材料。     

克隆植物早期结瘤素基因ENOD40的受体基因

ENOD40是根瘤器官形成过程中表达的植物早期结瘤素基因之一,通过调节细胞生长素和细胞激动素的平衡诱使根瘤形成.利用DupLex-A酵母双杂交系统,以豌豆ENOD40为诱饵,从豌豆根瘤的cDNA文库2.5x106个克隆中筛选了5个可能的ENOD40受体蛋白基因,以期了解调节ENOD40基因功能的分子机制,揭示根瘤形成过程中信号传导.DNA测序及同源性比较显示,4个克隆虽未在GenBank中找到同源性相近基因,仍有研究价值;1个克隆B'29编码的蛋白质与Laminin类受体蛋白有80%的同源性,作用机制可能相似,在根瘤形成过程中传递信号.但这5个可能的克隆还需进一步验证真伪,以便确认ENOD40是否可与多个基因作用或这几个克隆之间存在相关性.     

利用酵母双杂法鉴定水稻白叶枯病菌Ⅲ型效应物寄主靶标初探

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一。前期研究发现Xoo PXO99A中一个编码Ⅲ型效应物的PXO_03420（hpaF）基因与病菌游动性、致病性和致敏性有关,为探讨hpaF基因编码产物在病菌与日本晴水稻中的互作关系,本研究采用Matchmaker酵母双杂交系统构建了日本晴水稻叶片高质量cDNA文库,文库重组率为87.6%,滴度为2.57×10^6pfu/mL。将文库与构建的Y187/pGBKT7_03420诱饵进行酵母双杂交,共得到26个阳性克隆。通过对阳性克隆测序所得结果进行结构域分析,初步鉴定HpaF与水稻叶片中具有WHY或PRK结构域的两个蛋白存在互作关系。本研究结果为进一步研究hpaF基因的功能奠定了基础。     

非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选

非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制,严重影响棉花的产量和品质。为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库,获得的初级文库总克隆数为1.2×10⁷ CFU,次级文库总克隆数为1.6×10⁷ CFU,重组阳性率100%,酵母文库滴度为5.0×10⁷ cells·mL^-1,酵母克隆平均插入片段>1 000 bp,符合建库标准,可用于后续酵母双杂交筛选。以GhJAZ1为诱饵,构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体,经毒性检测及自激活活性检测,明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性,可直接用于酵母文库筛选。利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库,得到72个初筛阳性克隆,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。选取其中4个候选蛋白,利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。本...     

水稻抗稻瘟病防御系统中草酸氧化酶的鉴定

以水稻(Oryza sativa)OSK3蛋白激酶为诱饵，利用酵母双杂交系统中从水稻cDNA文库中筛选与其互作的蛋白，与植物抗病性相关的草酸氧化酶编码基因是所获得的阳性克隆之一，经检测报告基因lac Z的表达验证了互作的真实性。认为属于H2O2产生酶类的草酸氧化酶在水稻OSK3蛋白激酶介导的抗病途径中，可能是位于抗病信号传导链下游的蛋白。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中FoGAS1基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR的方法,从尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中克隆得到了FoGAS1基因的DNA及cDNA序列,并运用生物信息学的方法对该基因所编码的氨基酸序列进行分析,预测其编码蛋白质的结构和功能。结果表明,FoGAS1基因全长1 672 bp,其中开放阅读框全长1 623 bp,编码含有540个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白分子量为58398.1,等电点pI=4.83,为性质稳定的亲水性蛋白。FoGAS1蛋白为跨膜蛋白,含有22个丝氨酸磷酸化位点,2个苏氨酸磷酸化位点,8个酪氨酸磷酸化位点。该蛋白在C端有一个信号肽结构,为一种分泌蛋白。通过系统进化树分析,该蛋白在不同种属镰刀菌中高度保守。     

Brevibacillus brevis B011次级代谢物中抗青枯菌活性物质的纯化鉴定及生物合成基因簇分析

青枯病是世界上最为严重的植物细菌性病害之一，生物防治是防控其危害的热点研究领域，而分泌抑菌活性物质被认为是生防菌抑制病原菌的主要作用机制。本研究在前期筛选到对青枯菌有良好拮抗活性的短短芽孢杆菌B011(Brevibacillus brevis B011)基础上，采用色谱法分离纯化到抗青枯菌的主要活性物质，通过串联质谱和核磁波谱分析方法鉴定了其结构，并根据B011菌株全基因组序列，预测了活性化合物生物合成相关基因及其合成途径。结果表明，B. brevis B011次生代谢物中抑制青枯菌的主效活性物质为伊短菌素A(edeine A)，次效活性物质为N-乙酰基色胺[N-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)acetamide]。这两种化合物对青枯菌的抑制活性为首次报道。基因簇预测结果表明，B011菌株基因组中存在完整的edeine合成基因簇，共包括17个基因，即ede A～ede Q，且基因簇中的基因结构完整，基因序列高度保守。B011基因组中有多个N-乙酰基色胺的生物合成相关基因，包括17个脱羧酶编码基因和54个乙酰转移酶编码基因，可能分别参与色氨酸脱羧反应和色胺的乙酰基转移反应...     

应用酵母双杂交系统筛选与CASTOR相互作用的蛋白

CASTOR编码百脉根中的离子通道蛋白，它是共生途径上的功能基因，作用于结瘤因子诱导产生的钙离子激增（calcium spiking）信号转导途径的上游，突变后不能形成根瘤。为了进一步揭示CASTOR调控共生信号途径的分子机制，本文通过酵母双杂交系统在百脉根的cDNA文库中筛选可能与CASTOR相互作用的蛋白，以酵母配合的方法初筛获得111个阳性克隆，经β- Gal检测进一步确认有99个蓝色克隆子，测序以及NCBI BLAST比对分析鉴定出JAB1、CLPA、钙调素结合的翻译延伸因子等7种可能与CASTOR相互作用的蛋白，利用RT-PCR方法检测了这些基因在接种以及不接种根瘤菌的百脉根中的表达水平，分析推测CASTOR可能与上述蛋白形成复合物参与共生信号的转导。     

海岛棉纤维均一化酵母双杂交文库的构建与GbTCP5互作蛋白的筛选

为探究转录因子在海岛棉纤维中的生物学功能,以海岛棉8个时期的纤维为研究对象,利用SMART技术合成ds-cDNA,经DSN进行均一化处理,构建以pGADT7为载体的海岛棉纤维均一化酵母cDNA文库,利用酵母双杂交系统筛选与海岛棉GbTCP5互作的蛋白。根据克隆得到的GbTCP5基因的CDS区设计含有NcoⅠ、EcoRI酶切位点的引物,构建诱饵载体pGBKT7- GbTCP5。经自激活和毒性检测后共转化酵母菌株Y2HGold,筛选与GbTCP5互作的蛋白。实时荧光定量PCR显示,GbTCP5基因在纤维发育起始期和伸长期的表达量较高,且在花瓣和花萼中的表达量高于其他组织。文库的质量检测显示,构建的均一化cDNA文库库容为9.15×10⁷ cfu·mL^-1,重组率为100%,插入片段大小在500~2 000 bp之间。诱饵载体pGBKT7-GbTCP5通过酵母双杂交系统多次筛选、回转验证,最终确定了4个互作的蛋白,分别是GbTCP20、GbTCP42、GbTCP45和GbAHP1蛋白。海岛棉纤维均一化cDNA文库的构建和筛选,为进一步研究海岛棉TCP转录因子及其互作蛋白在纤维发育时期中的作用机制奠定了基础。     

苦瓜果实酵母双杂交文库构建及McRPF互作蛋白筛选

为研究苦瓜果实成熟的分子调控机制,以苦瓜自交系E12201-e1为材料,取不同成熟期苦瓜果肉组织等量混合,采用All-Direct方法构建酵母双杂交cDNA文库。经质量鉴定,该文库库容为1.25×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 200 bp,阳性率为100%,文库质量较高,符合建库标准。同时,以苦瓜果实成熟关键调控因子McRPF为诱饵,构建诱饵表达载体pGBKT7-McRPF。经鉴定该诱饵蛋白无自激活活性。利用共转化法,从文库中筛选到29个初始阳性菌落,经过DNA测序和BLAST比对分析,最终筛选得到12个可能与McRPF互作的蛋白,为进一步探究McRPF调控苦瓜果实成熟的分子机制奠定了理论基础。     

陆地棉酵母双杂交cDNA文库及VdSCP7诱饵载体的构建

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病是制约我国棉花生产的首要病害,严重影响棉花的产量与品质。为研究棉花与黄萎病菌互作的分子机制,本研究以国审棉百棉1号为材料,提取被大丽轮枝菌侵染的棉花根部总RNA,检测质量并用DNase Ⅰ处理后,用RNA 5'末端的模板转换方法,即SMART技术合成双链cDNA,再经酶切、过柱纯化去除短片段后,连接至pGADT7载体上构建棉花cDNA文库。VdSCP7是定位于寄主细胞核的大丽轮枝菌效应因子,能激发棉花的免疫反应,增强棉花抗病性。以大丽轮枝菌cDNA为模板扩增VdSCP7,产物纯化后重组到载体pGBKT7上构建诱饵载体pGBKT7-SCP7。诱饵载体经酶切及测序鉴定后,转化到酵母AH109中,鉴定诱饵蛋白毒性并检测诱饵载体是否存在自激活活性。结果表明,获得了库容量为2×10⁶ CFU的棉花cDNA文库,文库片段多样性良好,文库重组率约94%,质粒文库滴度约2.0×10⁹ CFU·mL^-1,满足酵母双杂交cDNA文库构建要求。酶切及测序结果表明,诱饵载体pGBKT7-SCP7构建成功且经过鉴定后无毒性、无自激活活性。本研究结果为棉花抗黄萎病基因的筛选及VdSCP7和棉花互作机制的解析奠定了基础。     

青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株构建及其生物学特性

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是植物细菌性青枯病的病原菌,为研制植物疫苗菌剂提供遗传稳定且突变位点明确的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,本研究利用EZ-Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体库,通过电击转化,筛选获得13株具有无致病力菌株形态的突变株。研究了其中5株突变株的插入位点和生物学特性,结果表明,其插入位点分别位于phcA和pchS基因,其生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91,而最适pH值和温度未改变。其发酵液经分光光度计扫描,结果显示,突变株在同一波长下的光吸收值均大于Rs91,经聚类分析,显示它们与Rs91可聚为不同的3类,即Rs91为第Ⅰ类,phcA基因突变株为第Ⅱ类,phcS基因突变株为第Ⅲ类。经番茄(Lycopersicon esculentum)盆栽苗致病力检测,15d后均未发病,确定为无致病力青枯雷尔氏菌。本研究为研制防治青枯病的植物疫苗菌剂提供了基础资料。     

Can wood ants distinguish between good and bad food patches on the forest floor?

Wood ants (Formica rufa group) normally feed on secretions of aphids to obtain carbohydrates, and on free-living invertebrates to obtain proteins. The availability of protein resources is usually unpredictable, and the demand for proteins is high during the period when ant larvae are developing. Thus, ants should select high quality food patches, i.e. patches with plenty of prey, when these are available. Foraging on the forest floor is seldom observed, but should be an alternative behaviour during periods of scarce food supply in the trees. To study the hunting behaviour of wood ants on soil invertebrates, ants were offered fly larvae (maggots) in two different quantities (six or two per pah) at two distances from an ant trail. Maggots exposed on the forest floor were found by randomly patrolling ant scouts regardless of bait quality. However, scouts that found the baits with six larvae recruited workers faster and, on average, four times as many workers were recruited to the six-larvae bait than to the bait with only two larvae. This indicates that ants can distinguish between poor and rich patches and that they are able to use this information to recruit more workers. Also, more workers were recruited and more maggots were carried away from patches nearby trails than from those far away. The results indicate that, during the warm season, ants explore and exhibit adaptive ‘foraging behaviour’ on the forest floor in the whole territory, not only close to trails. Consequently, wood ant feeding on soil invertebrates may be a common way for obtaining a large amounts of protein.     

烟草NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选

为探究NtMYB4a是否与其他蛋白质发生互作,并共同影响烟草次生代谢产物的合成和响应非生物胁迫,通过构建NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体,从烟草cDNA文库中筛选出与NtMYB4a互作的候选蛋白,并利用实时荧光定量PCR初步验证低温胁迫下候选蛋白和NtMYB4a的共表达关系。结果表明,从cDNA文库中初步筛选出39个与NtMYB4a互作的蛋白,经回交验证排除假阳性,最终得到6个与NtMYB4a具有互作关系的蛋白,分别是RALF-like 22蛋白、锌指A20/AN1结构域蛋白、液泡分选蛋白、天冬氨酸蛋白酶、B2蛋白和应激增强蛋白。在低温胁迫下,6种互作蛋白的基因表达量变化趋势与NtMYB4a相似,均呈升高—降低—升高的趋势。相关性分析发现,液泡分选蛋白、B2蛋白、RALF-like 22蛋白和应激增强蛋白基因的表达与NtMYB4a的表达呈正相关关系,锌指A20/AN1结构域蛋白和天冬氨酸蛋白酶基因的表达与NtMYB4a的表达呈较弱的负相关关系,推测NtMYB4a可能与这些蛋白互作参与烟草低温胁迫的防御调控。本研究结果为进一步探究NtMYB4a参与响应非生物胁迫的分子调控机制提供了依据。     

生物有机肥对烟草根际微生物群落及青枯雷尔氏菌丰度的影响

【目的】探究生物有机肥施用对烟草根际土壤细菌、真菌群落结构和青枯雷尔氏菌丰度的影响机理。【方法】选用长沙市某公司生产的生物有机肥和常规烟草专用肥,在湘西花垣县长期定位试验点连续5年开展大田试验,研究施肥对土壤理化性质和微生物群落的影响。试验设置两种施肥处理：常规烟草专用肥（CF）和生物有机肥（BOF）。【结果】与CF相比,施用生物有机肥处理的土壤烟草青枯病发病率降低了89.8%,同时青枯雷尔氏菌相对丰度也显著降低,降幅达40.1%;土壤pH、碱解氮和有效磷显著增加,分别增加了1.2%、12.1%和60.2%;施用生物有机肥后根际土壤微生物如Roseiflexaceae,Gemmatimonadaceae,Nitrospira,Ramophialophora,Preussia等显著富集,且这些潜在有益菌与青枯雷尔氏菌相对丰度呈显著负相关关系。通过ABT预测模型分析发现潜在有益菌是影响青枯雷尔氏菌相对丰度的最主要生物因子。【结论】连续5年的试验结果表明,施用生物有机肥不仅改善了作物生长的土壤环境,显著提高了土壤pH和土壤速效养分含量,还促使潜在有益菌在根际土壤中富集,抑制了青枯雷尔氏菌的生...