大白菜-结球甘蓝4号单体异附加系的鉴定

大白菜-结球甘蓝异附加系是利用结球甘蓝的优良基因对大白菜进行品种改良的中间材料,在遗传理论研究和育种实践中均具有重要应用价值。本研究以大白菜-结球甘蓝异源三倍体（AAC, 2n=29）与二倍体大白菜（AA,2n=20）回交一代的自交后代为材料,经过细胞学鉴定,从中筛选出大白菜-结球甘蓝4号单体异附加系,对其减数分裂和植株性状进行了观察与调查。该异附加系的获得为研究芸薹属A、C基因组的亲缘关系,以及向大白菜中导入结球甘蓝的优良基因,扩大种质遗传背景提供了基础材料。     

大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析

抽薹开花时间是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的重要性状,未熟抽薹直接影响大白菜的产量和品质.本研究以添加结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列为材料,结合抽薹性鉴定,获得了45株耐抽薹和15株易抽薹植株;利用cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)技术,对不同春化处理的耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离,获得了126条与抽薹性相关的差异表达条带,这些差异包括条带的有无和表达量的差异;通过差异条带回收、克隆和测序,获得了74条差异表达序列.同源性比对结果表明,61条差异表达序列具有同源序列,其中41条差异表达序列功能预测涉及代谢、能量、细胞物质运输、信号转导、表达调控、DNA修饰、细胞周期等,20条差异表达序列功能未知;13条在NCBI中找不到同源序列,可能是一些新基因.本研究获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝易位系,为耐抽薹大白菜新品种的培育提供新材料;同时获得了耐抽薹和易抽薹材料间的差异表达序列,为获得影响大白菜抽薹性的关键基因,揭示大白菜抽薹开花机制提供支撑.     

利用小麦微卫星引物建立偃麦草Ee染色体组特异SSR标记

选用40对小麦SSR引物对17份偃麦草(Thinopyrum sp．)、2份小麦(Triticum aestivum)材料进行了PCR扩增分析，从中筛选到引物Xgwm325能在不同偃麦草材料中扩增出4条长度分别为1400、440、120和100bp的特异DNA片段，可以作为偃麦草种质的特异SSR标记。利用小麦-二倍体长穗偃麦草(Th.elongatum)异代换系和异附加系对引物Xgwm325进行了扩增鉴定，结果只有100bp左右的片段出现在长穗偃麦草所有E^e组染色体上，该片段可以作为E^e染色体组的特异SSR标记。     

大白菜硫代葡萄糖甙合成基因SSR标记的开发

硫代葡萄糖甙(glucosinolates,GS)是一种含氮、硫的重要植物次生代谢产物,是十字花科蔬菜风味的主要来源。本研究根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)基因组序列信息,比对GS生物合成相关基因的序列信息,发现大白菜中与GS含量相关的候选基因102个,分布于10条染色体上。拟南芥GS合成基因在大白菜中的同源基因个数分别为:零拷贝基因8个、单拷贝基因13个、2拷贝基因17个、2个以上多拷贝基因14个。通过FASTPCR6.0软件分析目标基因上下游序列各5kb,共开发出237个简单重复序列(SSR)位点,16个基因没有发现SSR位点,72个基因存在1~4个SSR位点,5个基因存在5个SSR位点,4个基因存在6个SSR位点,4个基因存在7个SSR位点,1个基因存在8个SSR位点。所开发的SSR位点中,共发现4种重复类型:单核苷酸重复最多,共122个,占SSR总数的51.4%;其次是二核苷酸重复类型,共48个,占SSR总数的20.3%;三核苷酸重复类型最少,共7个,占SSR总数的3.0%,另外60个SSR无明显的重复类型。具有SSR位点的86个基因中,77个基因可以设计SSR特异引物,其中49对特异引物在供试的75份大白菜高代自交系中得到有效扩增。其中16对引物具有多态性,占全部引物的20.8%;18对引物无多态性,占全部引物的23.4%;15对引物杂带多,占全部引物的19.5%;另外28对引物无扩增产物,占全部引物的36.4%。最终11对获得了清晰多态性扩增产物,共检测出26个等位基因。本研究为分子标记辅助选择培育高有益GS成分的大白菜新品种提供了基础资料,进而加快大白菜营养品质育种的进程。     

小麦杀配子染色体单体附加系CS-2C的DNA甲基化变异分析

本研究利用MSAP方法检测普通小麦中国春(CS)、中国春-杀配子染色体2C单体附加系(CS-2C单体附加系)的DNA甲基化变异,探究DNA甲基化与杀配子染色体的关系。结果表明,CS-2C单体附加系5'-CCGG位点的胞嘧啶甲基化水平(45.33%)高于CS(40.35%),其中全甲基化率与半甲基化率均有所升高。与CS相比,CS-2C单体附加系的5'-CCGG位点发生了明显的胞嘧啶甲基化模式变异,以胞嘧啶甲基化升高为主,其中CG位点甲基化变异幅度高于CHG位点甲基化变异幅度。通过对甲基化差异片段进行测序鉴定,结果显示部分差异片段与普通小麦Sukkula-like转座子等具有高度同源性。由此推测,转座子可能在杀配子作用机制中起作用。本研究为揭示杀配子染色体的分子机制奠定了基础。     

小麦背景中披碱草部分染色体的FISH鉴定

为了建立小麦背景中粗穗披碱草(Elymus trachycaulus)和纤毛披碱草(Elymus ciliaris)染色体的跟踪鉴定方法,本研究利用寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的双色荧光原位杂交(FISH)和以(GAA)₈为探针的单色FISH,分别对4个小麦-粗穗披碱草附加系和5个小麦-纤毛披碱草附加系染色体进行分析。结果发现,经与小麦FISH核型比对后,建立了可用于追踪小麦背景中粗穗披碱草1S^t、5H^t、6H^t和7H^t染色体的标准FISH核型;而纤毛披碱草S^c和Y^c染色体FISH信号较弱。FISH检测发现,小麦-粗穗披碱草1S^t附加系自交自发变成了1S^t(1BS·3BL)代换系,且在其染色体组中检测到了一对T1BL·3BS易位染色体,同时发现5AS端部寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1序列发生了删除。另外,在小麦-粗穗披碱草5H^t附加系中发现2B染色体短臂末端删除现象,形成了2B-del和2BS-4AS·4AL易位染色体,而另一条2B和4A为正常的完整染色体。这种染色体结构重排事件表明,部分小麦-远缘物种附加系细胞学并不稳定,因此,繁种前后应对材料进行单株细胞学鉴定。上述小麦-粗穗披碱草染色体结构变异体的获得,为研究染色体结构重排与基因转录表达和表型变化的关系提供了研究基础。     

菜心BrAGL24基因mRNA在嫁接体中的长距离运输分析

为研究结球甘蓝/菜心嫁接体中开花调控基因的mRNA是否从砧木向接穗进行了运输,本试验以参与开花调控的菜心AGL24基因为研究对象,构建结球甘蓝菜心异源嫁接体,并从接穗结球甘蓝中鉴定菜心AGL24的序列。结果表明,利用结球甘蓝和菜心的转录组测序数据,拼接获得了结球甘蓝和菜心的AGL24基因序列(BoAGL24和BrAGL24)。利用菜心BrAGL24基因中的种间差异序列(C1~C7),在异源嫁接(结球甘蓝/菜心嫁接)的接穗结球甘蓝茎尖的转录组测序文库(T2)中筛选得到2条来自砧木菜心BrAGL24的reads。利用结球甘蓝BoAGL24的种间差异序列(G1~G7),分析结球甘蓝内源BoAGL24基因的转录表达量,发现异源嫁接的结球甘蓝茎尖中AGL24的表达量总体上高于同源嫁接的结球甘蓝茎尖中AGL24的表达量。异源嫁接使砧木菜心BrAGL24基因的mRNA运输到接穗结球甘蓝中,且增加了接穗结球甘蓝茎尖中内源BoAGL24基因的转录表达水平。本研究鉴定了菜心BrAGL24基因的mRNA运输特性,为进一步研究AGL24基因的mRNA运输与结球甘蓝/菜心嫁接启动接穗结球甘蓝开花机制奠定了一定的理论基础。     

大白菜与结球甘蓝种间异源多倍体的鉴定

利用异源多倍体作为桥梁材料是克服远缘杂交障碍,创制新种质和进行品种改良的一种重要途径.本研究对已获得的大白菜(Brassica campestrisL.ssp.pekinensis (Lour.) Olsson)与结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)种间异源四倍体和异源三倍体,利用形态学、解剖学、分子标记及细胞学等方法进行比较鉴定.研究表明,多倍体在植株形态、花器官和气孔大小等方面均表现出巨大性和超亲优势,其中四倍体比三倍体表现普遍更明显.多倍体的气孔密度显著的低于双亲.多倍体花粉生活力比双亲降低,四倍体花粉活力为81.56％,三倍体的花粉活力仅有18.78％.多倍体自交结实性明显低于双亲,四倍体自交结实率仅为0.28％;四倍体作为母本与大白菜杂交结籽率比其反交要高,是反交的2.11倍,以三倍体为母本或父本时与大白菜杂交,结实均非常低,且三倍体自交未获得种子.相关序列扩增多态性(SRAP)标记结果表明,多倍体中包含了双亲的遗传信息,但分f标记并不能区分四倍体与三倍体.细胞学观察显示,四倍体的染色体数目为2n=4x=38,三倍体的染色体数目为2n=3x=29.大白菜-结球甘蓝异源多倍体的鉴定为进一步大白菜品种改良和新种质的创制提供了基础资料.     

大白菜ABCB/PGP基因家族的鉴定与分析

ABCB/PGP蛋白为ABC转运蛋白的一个亚家族,能够参与植物中生长素的极性运输,在植物生长发育过程中具有重要作用。为深入认识大白菜ABCB/PGP基因家族,利用生物信息学方法对大白菜中ABCB/PGP基因家族成员进行了全基因组水平鉴定,并对其基因组信息、蛋白质生理生化特征、基因结构和系统进化等方面进行研究。结果表明,大白菜基因组中共鉴定到31个ABCB/PGP基因,这些基因在大白菜的10条染色体上分布不均,其中第3、4、6、7和9号染色体上分布有较多的家族成员。外显子-内含子基因结构分析表明,大部分ABCB/PGP基因都具有4～13个外显子。亚细胞定位预测分析发现,ABCB/PGP蛋白多数定位在细胞质膜上。进一步的系统进化分析表明,大白菜ABCB/PGP基因被聚类成6个分支,分别为CladeⅠ、CladeⅡ、CladeⅢ、CladeⅣ、CladeⅤ和CladeⅥ。上述研究结果为大白菜ABCB/PGP基因功能的研究奠定了一定的基础。     

利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导小麦-华山新麦草染色体易位的研究

小麦(Triticum aestivum)种质24-3-1是通过染色体工程手段获得的一个高抗条锈病的小麦-华山新麦草二体异附加系。为了提高其遗传稳定性,促进华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)优异基因的有效利用,对24-3-1进行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)化学处理来诱导易位系。本研究利用细胞学和基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)对其M2进行鉴定和易位系的筛选,并分析了不同EMS浓度对小麦-华山新麦草染色体易位的诱导效应。结果显示,在930个M2单株中共检测出了61个含有小麦-华山新麦草易位染色体的植株,易位频率为6.56%。其中7个单株检测出含有1条易位染色体,5个单株检测出含有1条易位染色体+1条华山新麦草染色体,20个单株检测出含有2条易位染色体,3个单株检测出含有3条易位染色体,26个单株检测出含有4条易位染色体。根尖细胞学观察和基因组原位杂交证明,含有2条易位染色体的单株为小麦-华山新麦草易位系;含有4条易位染色体的单株为小麦-华山新麦草易位-易位附加系。1.0%EMS为诱导小麦-华山新麦草染色体易位的最适浓度。本研究不仅为小麦特殊遗传材料的建立提供了重要的基因资源,同时也为小麦育种提供了新的种质。     

与大白菜TuMV抗病基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记开发

分子标记辅助选择可大大加快育种进程,然而由于大白菜抗病毒病遗传规律的复杂性,目前所定位的基因和筛选的连锁标记远不能满足育种需要,为了更好地对抗病毒病白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)进行分子标记辅助选择,本研究筛选了与大白菜抗芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记.本研究在对该基因进行定位的基础上,利用回交1代(backcross1,BC1)分离群体,采用分离群体分组分析法(bulked segregation analysis,BSA)、简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)和序列特异引物(sequence specific primer,SSP)标记技术,筛选与该基因紧密连锁的分子标记.通过对13对SSP引物和16对SSR引物的分析表明,有8对引物在两亲本间表现多态性,有5对引物扩增出的标记与基因TuRBCS01紧密连锁或共分离,分别为mBr4072、Bra025493-1、Bra025493-2、Bra025467-4和Bra025467-5.筛选出与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记2个,分别为SAAS_mBr4072_240 (1.5 cM)和Bra025493-1(1.0 cM),另有3个标记与基因TuRBCS01共分离,分别为SAAS—Bra025493-2_749、SAAS_ Bra025467-4—780和SAAS—Bra025467-5_ 956.上述标记丰富了大白菜抗TuMV分子标记的数量和种类,有望用于大白菜抗病毒病分子标记辅助选择.     

小麦中国春背景下长穗偃麦草Ee染色体组特异AFLP及STS标记的建立

为建立长穗偃麦草Ee染色体组特异的分子标记,以普通小麦中国春、中国春-长穗偃麦草二体代换系、附加系为材料,用5对AFLP引物进行分析,共筛选出28个分布于1Ee-7Ee 7个染色体特异的AFLP标记,经PAGE凝胶电泳后回收、克隆和测序,并根据测序结果设计PCR特异引物,成功地将AFLP标记E-ATC/M-CGTA341bp, E-ATT/M-CTAG265bp, E-AAT/M-CCAG139bp和E-ATT/M-CTAG205bp转化为实验结果稳定、操作更简单的STS标记。利用获得的STS标记对5个长穗偃麦草居群和8个小麦品种进行了鉴定。结果表明其可以在长穗偃麦草居群中被检测到,但在其它小麦背景中检测不到。表明这些标记可以用于小麦-长穗偃麦草异源附加系和代换系中长穗偃麦草遗传物种的检测。     

荔枝铜锌超氧物歧化酶基因的克隆与序列分析

以"三月红"荔枝基因组DNA为模板,用Cu*ZnSOD基因特异寡聚核苷酸为引物,进行PCR扩增,得到特异基因片段,将其克隆到pGEMT载体上,转化感受态大肠杆菌TG1中,对转化子中重组pGEMT上的Cu*ZnSOD基因片段的PCR扩增检测和序列分析,表明克隆成功;该基因片段有478个核苷酸,由4个外显子和3个内含子组成;外显子由234个核苷酸组成,编码78个氨基酸;该基因片段编码的氨基酸序列与水稻、玉米、番茄、大白菜和松树的Cu*ZnSOD基因编码的氨基酸序列的同源性分别为79.5%、73.1%、73.1%、71.8%和75.7%.     

Rim2因子超级家族的分布及分子指纹技术 在水稻品种鉴定中的应用*

通过GenBank中230Mb水稻序列的对比分析,新鉴定的水稻Rim2因子家族编码亚组和假基因亚组不均匀地分布于12条染色体上,以着丝点区域分布频率为最高。由基因内缺失和插入使得Rim2因子序列多变,结合其众多的拷贝数尝试将其开发为一新的分子指纹。以水稻(Oryzasativassp.indica)品种R963及其育种亲缘材料为测试样本,尽管材料间可能存在极其相近的遗传背景,利用Rim2因子设计的5个引物,还是检测出材料间DNA水平的差异。采用同样引物,对2份杂交籼稻(O.sativassp.indica)和1份杂交粳稻(O.sativassp.japonica)组合及相应亲本的PCR检测,获得所有材料的特异指纹。Rim2因子可作为水稻品种鉴别的分子指纹,也可应用于杂交稻纯度的快速鉴定。     

睾丸特异蛋白Y基因(TSPY)对奶牛早期胚胎性别的鉴定

为方便性别鉴定方法在现场应用,利用睾丸特异蛋白基因(TSPY)建立了奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法.设计并合成了TSPY雄性特异和雌、雄共有基因引物,并利用已知性别的奶牛血液DNA为模板,初步建立了性别鉴定的PCR反应体系和非电泳的性别鉴定方法.灵敏度试验结果显示,雄性特异引物和共有基因引物对在模板10～60 Pg时,其性别鉴定的准确率为100%,提示TSPY基因具备鉴定胚胎性别的可能;同时采用非电泳法和环介导的等温扩增(LAMP)法鉴定6枚胚胎的性别,两者结果完全一致;用非电泳法检测TSPY基因鉴定了43枚胚胎的性别,对其中鉴定为雌性的21枚胚胎分别移植给自然发情后6～8天的受体,结果9头出生的犊牛均为母牛.结果表明.TSPY基因是一个很好的雄性特异标记,非电泳检测TSPY基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定结果准确可靠.     

牦牛瘦素受体基因(LEPR)多态性分析

瘦素受体(LEPR)是瘦素(leptin)发挥作用的重要中介物.LEPR基因突变与人的肥胖,以及普通牛、猪等动物的脂肪沉积相关.本研究根据GenBank中普通牛(Bos tauras)LEPR基因序列设计3对引物,采用PCR-SSCP方法检测天祝白牦牛、甘南牦牛和青海牦牛(Bos grunniens)LEPR基因第4、5及8外显子及其相邻区域多态性.结果表明,牦牛LEPR基因第4外显子和第8外显子及其相邻区域分别存在多态性.对应普通牛LEPR基因序列,3类群牦牛该基因第4外显子及相邻区域检测到5处单碱基突变并形成2种等位基因A和B,第4外显子存在2处错义突变;该区域A为优势等位基因,PIC＜0.25为低度多态.3类群牦牛LEPR基因第8外显子及其相邻区域发现5处SNPs,其中第8外显子存在3处错义突变;等位基因在牦牛群体间分布不均衡,除天祝白牦牛发现6种等位基因A-F外,其余两类群牦牛仅发现3种等位基因A-C;3类群牦牛中A均为优势等位基因,该位点PIC>O.25,为中、高度多态且显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05).3类群牦牛LEPR基因第5外显子及相邻区域未发现多态性,但相对于普通牛该基因序列,在第4、5内含子区存在3处SNPs.LEPR基因第8外显子编码识别和结合相应配体的C2区,牦牛LEPR基因存在较丰富的多态性,可作为其调控性状的潜在分子标记位点.     

来自斯卑尔脱小麦新的抗条锈病基因YrSp的分子标记定位

摘要： 利用SSR分子标记技术，鉴定抗源来自斯卑尔脱小麦(Triticum spelta L.)的杂交组合分离群体温6/cp90.0.2.4.1(169/T.sp.al //宝丰7228)所携带抗条锈病(Puccinia striiformis Westend f. sp. tritric )基因是否为新基因，并对其进行染色体定位研究。经过对150对微卫星引物的筛选，发现位于3A染色体长臂上的Xgwm155引物所扩主带Xgwm155-147bp 与该基因表现连锁，连锁距离为40.5 cM，说明其位于3A染色体上。由于来自斯卑尔脱小麦的已知抗条锈病基因Yr5位于2B染色体长臂上，研究定位的位于3A染色体上的抗条锈病基因不同于Yr5，暂定名为YrSp。     

普通小麦背景中长穗偃麦草高分子量麦谷蛋白基因的表达、染色体定位与分子标记

摘要：以普通小麦（Triticum aestivum）中国春、长穗偃麦草?穴Thinopyrum elongatum ?雪及其双二倍体、二体异附加系、二体异代换系为材料，采用SDS-PAGE分析了种子高分子量麦谷蛋白亚基。长穗偃麦草高分子量麦谷蛋白基因在中国春背景中编码一条高分子量麦谷蛋白亚基，其迁移率与中国春1By8亚基相同，命名为1E8亚基，控制该亚基的基因位点Glu-E1位于长穗偃麦草E组染色体第一同源群的长臂上。用高分子量麦谷蛋白y亚基基因重复区域的特异引物进行扩增，长穗偃麦草1E8亚基编码基因（Glu-E1）扩增出1 300 bp的片段，而中国春1By8亚基编码基因（Glu-B1y）扩增出1 950 bp的片段。     

甘蓝花粉特异表达的多聚半乳糖醛酸酶基因BoMF9的克隆与特征分析

根据白菜花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF9的全长序列设计引物，通过PCR直接扩增的方法从结球甘蓝（Brassica. oleracea var. capitata）和芥蓝（B. oleracea var. alboglabra）中克隆得到BcMF9的同源基因BoMF9（BoMF9c和BoMF9l）。生物信息学分析和系统树构建发现BoMF9c和BoMF9l具有花粉特异表达的多聚半乳糖醛酸酶基因的序列特征。不同组织的表达特征分析发现它们分别在结球甘蓝和芥蓝的花蕾中特异表达。推测BoMF9c和BoMF9l可能在花粉萌发和花粉管伸长中起作用。     

利用InDel标记鉴定大白菜杂交种豫新四号种子纯度

InDel(insertion deletion length polymorphism)是基于基因组测序的第三代分子标记,已在一些作物的遗传研究中得到运用。本研究以大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)杂交种豫新四号及其亲本和8个同父异母、同母异父的杂交组合为实验材料,利用InDel标记和引物组合方法对大白菜杂交种纯度进行了快速鉴定。结果表明,从104对InDel引物中筛选到3对(BrID10667、BrID90107和BrID90147)在豫新四号及其亲本间表现多态性且带型清晰稳定,这3对InDel引物对两批杂交种进行检测,第一批材料所测纯度全部为98.00%。第二批材料所测纯度分别为:100.00%、98.30%和99.10%,与田间鉴定结果 100.00%的纯度高度一致,吻合度达99.13%。利用筛选出来的3对特异性InDel引物分别对豫新四号及其4个同母异父和4个同父异母的杂交组合进行InDel分析,没有一对引物能够将豫新四号以及其4个同母异父和4个同父异母杂交组合同时区分开来。然而在这3对引物中引物BrID90107和BrID10667退火温度相同均为55℃,但是各自扩增产物位置不同,应用引物组合BrID90107和BrID10667就可以将豫新四号与其亲本及4个同父异母和4个同母异父的杂交组合完全区分开。实验结果显示,InDel标记可以快速、准确、经济地鉴定大白菜杂交种纯度,同时证明,利用引物组合的方法可以更有效地鉴别大白菜杂交种子中的生物学混杂,表明InDel标记技术在大白菜杂交种纯度室内快速检测中具有广泛的应用前景。