分子标记和辐射技术在小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系创建中的应用

为了打破小麦抗赤霉病育种种质资源狭窄的局限,丰富抗赤霉病遗传材料,本研究通过对中国春-长穗偃麦草二体异代换系DS7E/7A与扬麦16杂交后代进行辐射诱变,以产生小麦-长穗偃麦草易位系选择群体,并结合赤霉病抗性鉴定和长穗偃麦草染色体特异分子标记辅助选择,最终获得了5个小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位单株,创建了一条有效获得小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系的技术路线。小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系的成功创建不仅为小麦抗赤霉病育种提供了重要的中间材料,也将为小麦近缘种的抗赤霉病研究和利用提供理论与实践参考。     

小麦背景中披碱草部分染色体的FISH鉴定

为了建立小麦背景中粗穗披碱草(Elymus trachycaulus)和纤毛披碱草(Elymus ciliaris)染色体的跟踪鉴定方法,本研究利用寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的双色荧光原位杂交(FISH)和以(GAA)₈为探针的单色FISH,分别对4个小麦-粗穗披碱草附加系和5个小麦-纤毛披碱草附加系染色体进行分析。结果发现,经与小麦FISH核型比对后,建立了可用于追踪小麦背景中粗穗披碱草1S^t、5H^t、6H^t和7H^t染色体的标准FISH核型;而纤毛披碱草S^c和Y^c染色体FISH信号较弱。FISH检测发现,小麦-粗穗披碱草1S^t附加系自交自发变成了1S^t(1BS·3BL)代换系,且在其染色体组中检测到了一对T1BL·3BS易位染色体,同时发现5AS端部寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1序列发生了删除。另外,在小麦-粗穗披碱草5H^t附加系中发现2B染色体短臂末端删除现象,形成了2B-del和2BS-4AS·4AL易位染色体,而另一条2B和4A为正常的完整染色体。这种染色体结构重排事件表明,部分小麦-远缘物种附加系细胞学并不稳定,因此,繁种前后应对材料进行单株细胞学鉴定。上述小麦-粗穗披碱草染色体结构变异体的获得,为研究染色体结构重排与基因转录表达和表型变化的关系提供了研究基础。     

小麦-顶芒山羊草2M染色体系的鉴定与评价

为了研究小麦-顶芒山羊草新种质材料的染色体组构成及开发其在育种中的利用价值,本研究利用分子标记和荧光原位杂交对小麦-顶芒山羊草杂交新种质进行鉴定,并通过小麦主要病害生理小种接种和农艺性状调查等方法对鉴定的材料进行综合评价。分子标记和原位杂交结果显示,所鉴定材料分别为小麦-顶芒山羊草2M附加系、2M(2D)代换系、2AS-2ML.2MS易位系和2DS-2ML.2MS易位系;抗病性鉴定结果表明,含2M染色体的材料均高抗小麦条锈病,其小麦亲本则高感条锈病,表明2M染色体上可能含有抗条锈病新基因;农艺性状调查分析结果表明,2M染色质导入小麦,可影响其小穗数、穗粒数和穗粒重等产量性状。因此,在创制和利用抗条锈病的小麦-顶芒山羊草2M染色体小片段易位系时,应加强对上述农艺性状的考察,并利用当前主栽品种进行回交改良。本研究鉴定出的抗条锈病小麦-顶芒山羊草2M染色体系丰富了小麦抗病基因库,为小麦育种提供了新抗源。     

小麦-中间偃麦草抗条锈病渗入系的分子细胞学鉴定

小麦品系CH5383是源于中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)的兼抗多种小麦病害的新种质。为明确其抗性来源和外源DNA片段的渗入位置,采用基因组原位杂交(GISH)和荧光原位杂交(FISH)对CH5383进行分析,GISH分析未发现外源信号,FISH结果观察到CH5383的3BL染色体端部与对照小麦(Triticum aestivum)品种中国春相比有明显的重组信号,初步推断CH5383染色体3BL端部可能有中间偃麦草DNA片段插入。用135对PLUG(PCR-based landmark unique gene)标记对CH5383、中国春和多个近缘物种进行扩增分析,发现位于3B染色体长臂端部的引物TNAC1383,能在CH5383和中间偃麦草中扩增出大约1 300 bp的特异DNA产物。从而进一步证实,CH5383是一个小麦-中间偃麦草小片段渗入系,携带抗条锈病基因的外源中间偃麦草DNA渗入片段位于3B染色体端部0.81-1.00区段。CH5383可以作为优异的小麦抗病育种新种质加以利用。     

杀配子染色体诱导小麦染色体畸变及其后代的细胞遗传学研究

本研究利用形态学和分子细胞遗传学研究方法对中国春-长穗偃麦草二体附加系与中国春-柱穗山羊草(2C)二体附加系的杂交后代F1、F2、F3进行研究,旨在探讨杀配子染色体诱导小麦-外源染色体畸变的频率,为小麦遗传育种提供材料基础。结果表明,杀配子染色体(2C)的丢失与恢复成二体,造成杂种F1、F2的减数分裂行为异常,杂种F3较前2代单价体数明显下降,相对紊乱系数明显低于F2。同时,杀配子染色体连续2次作用,使得附加系中ABDE染色体组受到严重影响,部分染色体产生缺失和易位,在后代传递中易于丢失,而外源E组染色体片段渗入到小麦染色体组中,使得染色体配对异常,产生非理论值的单价体数,导致后代育性下降或败育。本研究共检测F3植株448株,得到易位24株,缺失36株,小麦间易位19株,易位频率为5.36%,缺失频率为8.04%,染色体畸变总频率为13.39%。断裂位点的分布比率依次为:B组A组D组。本研究表明,杀配子染色体诱发染色体畸变频率高,且具有一定的方向性,是创造小麦遗传育种新材料的重要途径。     

普通小麦-华山新麦草易位系H9020-20-12-1-8抗条锈病基因SSR标记

H9020-20-12-1-8是一个通过杂交和回交选育的普通小麦（Triticum aestivum L.）华山新麦草（Psathyrostachys huashanica Keng.）易位系,苗期对中国小麦生产上流行的条锈菌（Puccinia striiforms f.sp.tritici）生理小种CYR32表现良好抗性。遗传分析表明,H9020-20-12-1-8对CYR32的抗病性是由1对显性基因YrHy（暂命名）独立控制的,通过对H9020-20-12-1-8和感病品种铭贤169杂交F2分离群体进行SSR分子标记,从305对SSR引物组合中筛选到3个与抗病基因YrHy紧密连锁的微卫星标记Xgwm429、Xwgm770和Xwmc154,与YrHy的遗传距离分别为5.4、6.4和11.3cM,将YrHy定位于小麦2BS染色体上。系谱分析及分子检测等结果表明,YrHy是一个源于华山新麦草的新抗条锈病基因。     

EMS诱导小麦易位系YW642突变体的鉴定与分子标记分析

抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642携带中间偃麦草抗黄矮病基因Bdv2。用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）处理抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642的种子6000粒,从M2中筛选出32类不同性状的突变体73株,表型变异率约为7.38%。对感黄矮病突变体的M3、M4代继续进行鉴定,证明18个感黄矮病突变体的突变...     

小麦-长穗偃麦草矮秆种质系的鉴定及遗传分析

矮源是进行小麦矮化育种的基础。本研究对2个小偃麦矮秆种质系31505-1和31505-2进行了分子鉴定和遗传分析。结果表明,31505-1和31505-2是2个不同的矮秆小偃麦易位系,31505-1中易位的偃麦草染色体片段位于2D染色体;对矮秆小偃麦种质系与不同株高材料杂交后代的株高和节间长度进行了分析,发现2个种质系的后代致矮率可达16%~23%,其株高的降低主要由节间长度的变化引起的,其中倒2节间与株高的变化相关性最高。本研究对拓宽小麦矮秆种质资源基础具有一定意义。     

小麦中国春背景下长穗偃麦草Ee染色体组特异AFLP及STS标记的建立

为建立长穗偃麦草Ee染色体组特异的分子标记,以普通小麦中国春、中国春-长穗偃麦草二体代换系、附加系为材料,用5对AFLP引物进行分析,共筛选出28个分布于1Ee-7Ee 7个染色体特异的AFLP标记,经PAGE凝胶电泳后回收、克隆和测序,并根据测序结果设计PCR特异引物,成功地将AFLP标记E-ATC/M-CGTA341bp, E-ATT/M-CTAG265bp, E-AAT/M-CCAG139bp和E-ATT/M-CTAG205bp转化为实验结果稳定、操作更简单的STS标记。利用获得的STS标记对5个长穗偃麦草居群和8个小麦品种进行了鉴定。结果表明其可以在长穗偃麦草居群中被检测到,但在其它小麦背景中检测不到。表明这些标记可以用于小麦-长穗偃麦草异源附加系和代换系中长穗偃麦草遗传物种的检测。     

小麦-鹅观草易位系T7A/1Rk#1的选育与鉴定

将小麦-鹅观草del1Rk#1L二体添加系的花粉用10 Gy 60Co γ射线照射处理,给小麦中国春授粉,获得杂种。综合利用C-分带、GISH、顺次C带/45SrDNA-FISH和顺次GISH/45SrDNA-FISH等分子细胞遗传学技术在M2代筛选和鉴定出1个涉及小麦7A和鹅观草1Rk#1染色体的相互易位染色体系,并获得1Rk#1染色体的1个45SrDNA位标,该位标和其对应的红色GISH-带纹能够特异地识别1Rk#1染色体短臂。对M2代群体染色体组成分析和测交分析表明,两条易位染色体在后代中以共分离方式成对出现,且易位通过雌配子的传递率高于雄配子。综合2004、2005和2006 3年的赤霉病抗性鉴定结果表明：该易位系对赤霉病表现部分抗病,但抗性表现在不同年份、不同地点有差异。试验还证明花粉辐射是诱导小麦-外缘物种染色体易位的有效方法。     

矮秆早熟小偃麦种质山农0057-2的选育与鉴定

利用普通小麦(Triticum aestivum)品种烟农15与中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)杂交、回交和多代自交,从BC3F6中选育出一个矮秆、早熟新种质山农0057-2.综合应用形态学、细胞学、生物化学、分子生物学等方法对其进行鉴定.结果表明,山农0057-2平均株高64.2 cm,较烟农15降低14.6 cm;抽穗期和开花期均比烟农15提前4～5 d.其根尖染色体数目为2n=42,花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(PMC M Ⅰ)染色体构型为2n=0.24 Ⅰ+20.88 Ⅱ;它与烟农15的杂种F1在PMC M Ⅰ有80.49%的细胞形成21个二价体,未观察到多价体.高分子量麦谷蛋白亚基的SDS-PAGE鉴定结果表明,山农0057-2含有1条中间偃麦草的特异带;从202对SSR引物中筛选出2对引物(Xgwm234-5A/5BS和BARC172-7DL)能在山农0057-2中扩增出不同的中间偃麦草特异带,分别标记为Xgwm234300和BARC172400.山农0057-2是一个含有中间偃麦草染色体(片段)的种质材料,具有矮秆、早熟等优点,在小麦育种中具有重要的利用价值.     

小麦远缘杂交种质资源创新

小麦近缘种是改良小麦的一个重要基因库, 具有许多栽培小麦所不具备的优良特性。我们通过远缘杂交、染色体工程的方法创制了一大批不同类型的材料, 经基因组原位杂交GISH、多色FISH 和特异分子标记鉴定, 抗条锈病、白粉病、叶锈病鉴定, 品质、营养性状以及产量性状鉴定, 共选育出10 类可为育种家利用的抗病、优质、富含微量营养元素、氮高效、丰产性状优良的远缘杂交新种质和新不育系种质; 开发了414对黑麦基因组专化的EST 引物, 31 个黑麦染色体(臂)专化的EST 分子标记, 可应用于分子标记辅助育种, 或追踪检测小麦背景中的黑麦染色体或染色体片段; 进行了抗病新基因的遗传分析和分子标记定位工作。利用新种质, 选育出了一批表现突出的抗病、营养高效的小麦-黑麦、小麦-冰草远缘杂交新品系     

利用小麦微卫星引物建立偃麦草Ee染色体组特异SSR标记

选用40对小麦SSR引物对17份偃麦草(Thinopyrum sp．)、2份小麦(Triticum aestivum)材料进行了PCR扩增分析，从中筛选到引物Xgwm325能在不同偃麦草材料中扩增出4条长度分别为1400、440、120和100bp的特异DNA片段，可以作为偃麦草种质的特异SSR标记。利用小麦-二倍体长穗偃麦草(Th.elongatum)异代换系和异附加系对引物Xgwm325进行了扩增鉴定，结果只有100bp左右的片段出现在长穗偃麦草所有E^e组染色体上，该片段可以作为E^e染色体组的特异SSR标记。     

含抗白粉病新基因普通小麦-黑麦1R二体异附加系的遗传学鉴定

黑麦（Secale cereale）含有丰富的优良基因,在小麦遗传改良中具有重要利用价值。为了鉴定普通小麦（Triticum aestivum）与奥地利黑麦杂交后代选育的抗白粉病品系N9436-1的黑麦遗传物质,对其进行了细胞学、基因组原位杂交、Giemsa-C分带、SCAR（sequence characterized amplified region）标记以及酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)分析。结果表明,N9436-1形态学和细胞学稳定,2n=44=22Ⅱ,对白粉病免疫,携带奥地利黑麦的多小穗性状。以奥地利黑麦总基因组DNA为探针的原位杂交结果及Giemsa C-分带显示,N9436-1含有2条奥地利黑麦的1R染色体, SCAR标记鉴定及A-PAGE分析进一步证实N9436-1携带有黑麦遗传物质,表明N9436-1携带的抗白粉病基因不同于Pm8和Pm17,是新的抗白粉病基因,可作为白粉病抗源用于小麦抗病育种。     

小麦-黑麦1BL/1RS易位系7-1抗纹枯病的分子细胞学鉴定

黑麦(Secale cereale)是小麦(Triticum aestivum)的重要三级基因源,具有小麦改良所需要的多种优良性状。为丰富小麦杂交育种新的种质资源,利用墨西哥黑麦(2n=2x=14,RR)与普通优质小麦W770B(2n=6x=42,AABBDD)杂交,经过多年筛选,选出若干优良性状的衍生系,在小麦五叶期时用PDA培养基培养的带纹枯病菌的牙签,接菌到小麦芽鞘内,温室内培养,5周后鉴定纹枯病发病等级,计算病情指数,为了结果的准确性,经过多次牙签法鉴定,筛选出病情指数为PI=32.8%的抗病衍生系7-1。为明确衍生系7-1的遗传成分,本研究综合采用形态学、细胞遗传学、基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)、特异序列扩增(sequence characterized amplified region,SCAR)分子标记、简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记和醇溶蛋白分析。对7-1的根尖细胞和花粉母细胞的细胞遗传学观察表明7-1染色体结构和数目稳定2n=42=21Ⅸ;以黑麦DNA为探针的GISH分析观察表明7-1含有两个黑麦染色体臂;黑麦基因组SCAR标记分析表明,D15和P13LF/R能够在黑麦和7-1中扩增出黑麦特异条带,黑麦1RS SCAR标记分析表明,ω-sec-p1/ω-sec-p2、ω-sec-p3/ω-sec-p4和IB-267能够在黑麦和7-1中扩增出黑麦目的条带,说明7-1具有黑麦1RS染色体;筛选小麦每条染色体长短臂上的多对引物,在7-1中只有1BS上的引物Xgwm264和Xgwm11未能扩增出相应条带,其余染色体上的引物均扩增出了条带,说明7-1中缺失了小麦1BS染色体;醇溶蛋白分析表明7-1中扩增出了1RS黑麦碱条带,由此证实了小麦染色体1BS被黑麦染色体1RS所替换,该材料为小麦-黑麦1BL/1RS易位系。本研究中7-1为抗纹枯病的1BL/1RS易位系,为小麦纹枯病抗病育种提供了新的种质资源,拓宽了小麦育种材料。     

抗条锈病的小麦-非洲黑麦异代换系的分子细胞学鉴定

黑麦属(Secale)物种是改良小麦条锈病抗性的优良供体,为发掘和利用黑麦属野生种非洲黑麦(S.africanum)所携带的优异抗小麦条锈病基因,本研究在硬粒小麦(Triticum durum)-非洲黑麦双二倍体(基因组为AABBRaRa)和小麦(T.aestivum)杂交的高代材料中发现了一个免疫条锈病的株系HH41.HH41的体细胞染色体数目为2n=42.用小麦D基因组特异重复序列pAsl和秦岭黑麦(S.cereale)基因组总DNA作为探针的顺序原位杂交分析表明,HH41中一对小麦6D染色体被一对非洲黑麦6Ra染色体所代换.利用开发的基于表达序列标签的6R/6Ra特异分子标记也证实了HH41缺少6D特征带,具有6Ra特征带,是6Ra(6D)代换系.条锈菌生理小种(Puccinia striiformis Eriks.f sp.tritici)接种鉴定结果表明其抗条锈病性源自6Ra染色体.本研究还综合利用分子细胞学证据将来自非洲黑麦的6Ra染色体与栽培黑麦的6R染色体的多态性进行了比较,证实了6R(6D)代换系HH41是一种具有古老野生黑麦优异抗性的特殊珍贵材料,是创造异易位系、实现外源基因转移和改良小麦的重要资源.     

普通小麦-柔软滨麦草易位系M8657-1抗条锈病基因遗传分析与SSR标记

为明确小麦(Triticum aestivum)-柔软滨麦草(Leymus mollis(Trin.)Hara)易位系M8657-1的抗条锈性,用中国小麦条锈菌(Puccinia striiform f.sp.stritici)流行小种条中30号、条中31号、水源11-4和水源11-11生理小种,对M8657-1和铭贤169的杂交后代进行苗期抗条锈性遗传分析.结果表明,易位系M8657-1对条中30号和水源11-11的抗条锈性均1对隐性核基因控制;对条中31号的抗条锈性由2对显性核基因(互补作用)控制;对水源11-4的抗条锈性由1对显性核基因控制.将控制水源11-4抗病性的基因暂时命名为YrElm1-4,以接种水源11-4的F2正交群体为研究对象,应用BSA法进行了SSR分析.从320对SSR引物组合中筛选到3个与主效抗病基因YrElm1-4连锁的多态性微卫星标记,它们分别是Xgwm636、Xwmc522和Xwmc453,根据3个微卫星标记位点的染色体位置,推出YrElm1-4位于小麦2AS染色体上,这3个标记可用丁分子标记辅助育种.     

六倍体小偃麦与普通小麦杂交后代的分子细胞遗传学检测

为了改良六倍体小偃麦,创制携带E组染色体优良基因的普通小麦新类型。本研究利用六倍体小偃麦与克旱9号杂交选育六倍体小偃麦的衍生系,在杂交后代中选择具有六倍体小偃麦优良农艺性状的普通小麦类型。结果表明:六倍体小偃麦与普通小麦杂交结实率低,平均为21.9%,但F2以后分离复杂,出现一些代换系、易位系,附加系和DE混合的染色体组。有些品系性状表现较好,如分蘖多、抗病、多小穗、多花等。按性状继代选择直至F5共筛选出13个品系即05-9-2、05-9-4、05-9-5、05-9-6、05-9-7、05-9-8、05-9-11、05-9-14、9-9-14、05-9-13、05-7-13、05-7-24、05-7-22。利用花粉母细胞减数分裂观察,分子检测方法、原位杂交技术对以上13个品系进行了鉴定。以期为进一步研究和利用E组染色体改良普通小麦提供理论基础。     

小麦-柔软滨麦草易位系M853-4抗条锈病基因的遗传分析和SSR标记定位

用中国小麦条锈菌(Puccinia stniform f.sp.stritici)流行小种条中29号、条中30号、条中31号和水源11-11生理小种,对小麦(Triticum aestivum)-柔软滨麦草(Elymus mollis)易位系M853-4和铭贤169的杂交后代进行苗期抗条锈性遗传分析.结果表明,易位系M853-4对条中29号、条中30号和条中31号的抗病性均由1对显性核基因控制;对水源11-11的抗病性由1对显性和1对隐性基因共同控制.将控制条中31号抗病性的基因暂时命名为YrElm4.以接种条中31号的F2正交群体为研究对象,应用BSA法进行了SSR分析.从320对SSR引物组合中筛选到3个与主效抗病基因YrE1m4连锁的多态性微卫星标记,它们分别是Xwmc654、Xgwm304和Xgwm129,与YrE1m4的遗传距离依次为5.8、7.1和10.3 cM,并将YrE1m4定位于小麦5AS染色体,这3个标记可用于分子标记辅助育种.     

小麦-大麦大穗大粒渐渗系WB13的分子细胞学鉴定

小麦新种质WB13是普通小麦(Triticum aestivum L.)品种7182与农家二棱大麦(Hordeum vulgare ssp.distichon Hsü.)杂交后回交多代衍生而来的大穗大粒材料。为了明确WB13的遗传基础,本研究利用形态学、细胞学、分子标记及特异片段回收测序等技术对其进行了鉴定。结果表明,采用小麦不同同源群简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记对WB13和小麦7182进行遗传背景分析发现,两者遗传相似系数(genetic similarity coefficient,GS)达97.0%,田间表现为大穗、大粒,综合农艺性状较好;根尖细胞染色体数目为2n=42,以大麦基因组DNA为探针进行基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)未出现杂交信号;利用大麦特异序列标签位点(sequence-tagged site,STS)标记对WB13和农家二棱大麦进行扩增,发现ABG054(4H)和ABC305B(7H)两个标记在WB13中扩增出了大麦特征条带(分别记为WS1和WS3),经测序及序列比对,发现其与扩增到的大麦序列分别具有100%和98%的相似性,与EMBL数据库中的序列比对,与两者有相似性的全为大麦的序列。利用大麦4H和7H染色体上的35对SSR引物对WB13及其亲本进行扩增,发现与千粒重相关的标记MGB396(4H)在WB13中扩增出了大麦的特异条带。综合以上结果确定WB13含有大麦4H和7H染色体的遗传物质,为小麦-大麦渐渗系材料,且4H染色体渗入片段中可能携带与千粒重相关的有益基因。本研究确定了WB13为小麦-大麦杂种后代,此材料的育成丰富了小麦-大麦中间材料和大穗大粒材料的种质资源。同时本研究在分子水平上初步揭示了WB13大穗大粒特性的成因,为后续构建遗传分析群体进行相关数量性状(quantitative trait loci,QTL)定位及推动WB13的研究利用积累了基础资料。