利用小麦微卫星引物建立偃麦草Ee染色体组特异SSR标记

选用40对小麦SSR引物对17份偃麦草(Thinopyrum sp．)、2份小麦(Triticum aestivum)材料进行了PCR扩增分析，从中筛选到引物Xgwm325能在不同偃麦草材料中扩增出4条长度分别为1400、440、120和100bp的特异DNA片段，可以作为偃麦草种质的特异SSR标记。利用小麦-二倍体长穗偃麦草(Th.elongatum)异代换系和异附加系对引物Xgwm325进行了扩增鉴定，结果只有100bp左右的片段出现在长穗偃麦草所有E^e组染色体上，该片段可以作为E^e染色体组的特异SSR标记。     

矮秆早熟小偃麦种质山农0057-2的选育与鉴定

利用普通小麦(Triticum aestivum)品种烟农15与中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)杂交、回交和多代自交,从BC3F6中选育出一个矮秆、早熟新种质山农0057-2.综合应用形态学、细胞学、生物化学、分子生物学等方法对其进行鉴定.结果表明,山农0057-2平均株高64.2 cm,较烟农15降低14.6 cm;抽穗期和开花期均比烟农15提前4～5 d.其根尖染色体数目为2n=42,花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(PMC M Ⅰ)染色体构型为2n=0.24 Ⅰ+20.88 Ⅱ;它与烟农15的杂种F1在PMC M Ⅰ有80.49%的细胞形成21个二价体,未观察到多价体.高分子量麦谷蛋白亚基的SDS-PAGE鉴定结果表明,山农0057-2含有1条中间偃麦草的特异带;从202对SSR引物中筛选出2对引物(Xgwm234-5A/5BS和BARC172-7DL)能在山农0057-2中扩增出不同的中间偃麦草特异带,分别标记为Xgwm234300和BARC172400.山农0057-2是一个含有中间偃麦草染色体(片段)的种质材料,具有矮秆、早熟等优点,在小麦育种中具有重要的利用价值.     

利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导小麦-华山新麦草染色体易位的研究

小麦(Triticum aestivum)种质24-3-1是通过染色体工程手段获得的一个高抗条锈病的小麦-华山新麦草二体异附加系。为了提高其遗传稳定性,促进华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)优异基因的有效利用,对24-3-1进行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)化学处理来诱导易位系。本研究利用细胞学和基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)对其M2进行鉴定和易位系的筛选,并分析了不同EMS浓度对小麦-华山新麦草染色体易位的诱导效应。结果显示,在930个M2单株中共检测出了61个含有小麦-华山新麦草易位染色体的植株,易位频率为6.56%。其中7个单株检测出含有1条易位染色体,5个单株检测出含有1条易位染色体+1条华山新麦草染色体,20个单株检测出含有2条易位染色体,3个单株检测出含有3条易位染色体,26个单株检测出含有4条易位染色体。根尖细胞学观察和基因组原位杂交证明,含有2条易位染色体的单株为小麦-华山新麦草易位系;含有4条易位染色体的单株为小麦-华山新麦草易位-易位附加系。1.0%EMS为诱导小麦-华山新麦草染色体易位的最适浓度。本研究不仅为小麦特殊遗传材料的建立提供了重要的基因资源,同时也为小麦育种提供了新的种质。     

蓝粒小麦4Ag染色体的显微分离与鉴定

本研究采用显微分离技术从蓝粒小麦(Triticum aestivum L.(2n=6x=42)×Thinopyrum ponticum Liu &Wang(2n=10x=70))根尖细胞中期分裂相中分离出具有4Ag染色体形态特征的单条染色体,对分离后的细胞进行原位杂交(FISH),结果显示细胞中所剩的和显微分离到的单条染色体均为4Ag染色体.利用Sau3A接头介导的PCR方法对分离出的单条4Ag染色体进行体外扩增,扩增的DNA片段大小约为200～2 000 bp,主要集中在250～750 bp之间.以DIG-dUTP标记的蓝粒基因组DNA为探针,与该扩增产物进行Southern杂交,结果表明显微分离出的染色体得到了有效的扩增.利用该分离染色体的PCR扩增产物为探针,对蓝粒小麦进行原位杂交,证明显微分离的染色体体外扩增片段确实来源于4Ag染色体.本研究拓宽了染色体显微分离的范围,为构建4Ag染色体文库和克隆位于该染色体上的重要农艺性状基因提供了新途径.     

分子标记和辐射技术在小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系创建中的应用

为了打破小麦抗赤霉病育种种质资源狭窄的局限,丰富抗赤霉病遗传材料,本研究通过对中国春-长穗偃麦草二体异代换系DS7E/7A与扬麦16杂交后代进行辐射诱变,以产生小麦-长穗偃麦草易位系选择群体,并结合赤霉病抗性鉴定和长穗偃麦草染色体特异分子标记辅助选择,最终获得了5个小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位单株,创建了一条有效获得小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系的技术路线。小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系的成功创建不仅为小麦抗赤霉病育种提供了重要的中间材料,也将为小麦近缘种的抗赤霉病研究和利用提供理论与实践参考。     

小偃麦渗入系抗条锈性评价及细胞学鉴定

为将中间偃麦草的抗条锈病基因导入小麦,以八倍体小偃麦TAI7047为桥梁亲本,与普通小麦杂交、回交,结合细胞学鉴定选育抗条锈病小麦-异源渗入系;并通过人工接种在温室和田间病圃对育成的82份渗入系进行了连续2年的苗期、成株期抗病性鉴定筛选。筛选到38份免疫我国优势小种CYR32、CYR33和新小种v26;45份免疫CYR32、CYR33小种;51份免疫CYR32;48份免疫CYR33;52份免疫v26。且它们的抗性均来自中间偃麦草。对随机选取的3份抗病渗入系及其与中国春小麦的杂交F1进行了染色体计数和配对分析。结果表明,它们的染色体数目均为2n=42,且3个测试材料及其与中国春杂种F1的平均配对构型分别为2n=0.26I+20.79II+0.05III和2n=0.37I+20.68II+0.09III。说明小偃麦抗病渗入系具有与普通小麦相似的染色体结构和规则的配对构型,为小麦抗病育种提供了新抗源。     

小麦远缘杂交种质资源创新

小麦近缘种是改良小麦的一个重要基因库, 具有许多栽培小麦所不具备的优良特性。我们通过远缘杂交、染色体工程的方法创制了一大批不同类型的材料, 经基因组原位杂交GISH、多色FISH 和特异分子标记鉴定, 抗条锈病、白粉病、叶锈病鉴定, 品质、营养性状以及产量性状鉴定, 共选育出10 类可为育种家利用的抗病、优质、富含微量营养元素、氮高效、丰产性状优良的远缘杂交新种质和新不育系种质; 开发了414对黑麦基因组专化的EST 引物, 31 个黑麦染色体(臂)专化的EST 分子标记, 可应用于分子标记辅助育种, 或追踪检测小麦背景中的黑麦染色体或染色体片段; 进行了抗病新基因的遗传分析和分子标记定位工作。利用新种质, 选育出了一批表现突出的抗病、营养高效的小麦-黑麦、小麦-冰草远缘杂交新品系     

小麦-大麦大穗大粒渐渗系WB13的分子细胞学鉴定

小麦新种质WB13是普通小麦(Triticum aestivum L.)品种7182与农家二棱大麦(Hordeum vulgare ssp.distichon Hsü.)杂交后回交多代衍生而来的大穗大粒材料。为了明确WB13的遗传基础,本研究利用形态学、细胞学、分子标记及特异片段回收测序等技术对其进行了鉴定。结果表明,采用小麦不同同源群简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记对WB13和小麦7182进行遗传背景分析发现,两者遗传相似系数(genetic similarity coefficient,GS)达97.0%,田间表现为大穗、大粒,综合农艺性状较好;根尖细胞染色体数目为2n=42,以大麦基因组DNA为探针进行基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)未出现杂交信号;利用大麦特异序列标签位点(sequence-tagged site,STS)标记对WB13和农家二棱大麦进行扩增,发现ABG054(4H)和ABC305B(7H)两个标记在WB13中扩增出了大麦特征条带(分别记为WS1和WS3),经测序及序列比对,发现其与扩增到的大麦序列分别具有100%和98%的相似性,与EMBL数据库中的序列比对,与两者有相似性的全为大麦的序列。利用大麦4H和7H染色体上的35对SSR引物对WB13及其亲本进行扩增,发现与千粒重相关的标记MGB396(4H)在WB13中扩增出了大麦的特异条带。综合以上结果确定WB13含有大麦4H和7H染色体的遗传物质,为小麦-大麦渐渗系材料,且4H染色体渗入片段中可能携带与千粒重相关的有益基因。本研究确定了WB13为小麦-大麦杂种后代,此材料的育成丰富了小麦-大麦中间材料和大穗大粒材料的种质资源。同时本研究在分子水平上初步揭示了WB13大穗大粒特性的成因,为后续构建遗传分析群体进行相关数量性状(quantitative trait loci,QTL)定位及推动WB13的研究利用积累了基础资料。     

小麦-长穗偃麦草矮秆种质系的鉴定及遗传分析

矮源是进行小麦矮化育种的基础。本研究对2个小偃麦矮秆种质系31505-1和31505-2进行了分子鉴定和遗传分析。结果表明,31505-1和31505-2是2个不同的矮秆小偃麦易位系,31505-1中易位的偃麦草染色体片段位于2D染色体;对矮秆小偃麦种质系与不同株高材料杂交后代的株高和节间长度进行了分析,发现2个种质系的后代致矮率可达16%~23%,其株高的降低主要由节间长度的变化引起的,其中倒2节间与株高的变化相关性最高。本研究对拓宽小麦矮秆种质资源基础具有一定意义。     

小麦背景中披碱草部分染色体的FISH鉴定

为了建立小麦背景中粗穗披碱草(Elymus trachycaulus)和纤毛披碱草(Elymus ciliaris)染色体的跟踪鉴定方法,本研究利用寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的双色荧光原位杂交(FISH)和以(GAA)₈为探针的单色FISH,分别对4个小麦-粗穗披碱草附加系和5个小麦-纤毛披碱草附加系染色体进行分析。结果发现,经与小麦FISH核型比对后,建立了可用于追踪小麦背景中粗穗披碱草1S^t、5H^t、6H^t和7H^t染色体的标准FISH核型;而纤毛披碱草S^c和Y^c染色体FISH信号较弱。FISH检测发现,小麦-粗穗披碱草1S^t附加系自交自发变成了1S^t(1BS·3BL)代换系,且在其染色体组中检测到了一对T1BL·3BS易位染色体,同时发现5AS端部寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1序列发生了删除。另外,在小麦-粗穗披碱草5H^t附加系中发现2B染色体短臂末端删除现象,形成了2B-del和2BS-4AS·4AL易位染色体,而另一条2B和4A为正常的完整染色体。这种染色体结构重排事件表明,部分小麦-远缘物种附加系细胞学并不稳定,因此,繁种前后应对材料进行单株细胞学鉴定。上述小麦-粗穗披碱草染色体结构变异体的获得,为研究染色体结构重排与基因转录表达和表型变化的关系提供了研究基础。     

小麦-黑麦1BL/1RS易位系7-1抗纹枯病的分子细胞学鉴定

黑麦(Secale cereale)是小麦(Triticum aestivum)的重要三级基因源,具有小麦改良所需要的多种优良性状。为丰富小麦杂交育种新的种质资源,利用墨西哥黑麦(2n=2x=14,RR)与普通优质小麦W770B(2n=6x=42,AABBDD)杂交,经过多年筛选,选出若干优良性状的衍生系,在小麦五叶期时用PDA培养基培养的带纹枯病菌的牙签,接菌到小麦芽鞘内,温室内培养,5周后鉴定纹枯病发病等级,计算病情指数,为了结果的准确性,经过多次牙签法鉴定,筛选出病情指数为PI=32.8%的抗病衍生系7-1。为明确衍生系7-1的遗传成分,本研究综合采用形态学、细胞遗传学、基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)、特异序列扩增(sequence characterized amplified region,SCAR)分子标记、简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记和醇溶蛋白分析。对7-1的根尖细胞和花粉母细胞的细胞遗传学观察表明7-1染色体结构和数目稳定2n=42=21Ⅸ;以黑麦DNA为探针的GISH分析观察表明7-1含有两个黑麦染色体臂;黑麦基因组SCAR标记分析表明,D15和P13LF/R能够在黑麦和7-1中扩增出黑麦特异条带,黑麦1RS SCAR标记分析表明,ω-sec-p1/ω-sec-p2、ω-sec-p3/ω-sec-p4和IB-267能够在黑麦和7-1中扩增出黑麦目的条带,说明7-1具有黑麦1RS染色体;筛选小麦每条染色体长短臂上的多对引物,在7-1中只有1BS上的引物Xgwm264和Xgwm11未能扩增出相应条带,其余染色体上的引物均扩增出了条带,说明7-1中缺失了小麦1BS染色体;醇溶蛋白分析表明7-1中扩增出了1RS黑麦碱条带,由此证实了小麦染色体1BS被黑麦染色体1RS所替换,该材料为小麦-黑麦1BL/1RS易位系。本研究中7-1为抗纹枯病的1BL/1RS易位系,为小麦纹枯病抗病育种提供了新的种质资源,拓宽了小麦育种材料。     

矮化型八倍体小偃麦的选育

矮化型八倍体小偃麦“TAI7044”是以天蓝偃麦草(Agropyron glaucum)作父本，春小麦品种“晋春7号”作母本杂交，并采用冬小麦品种“21124”回交克服其属间杂种的不育性，经过连续9年选育而成。细胞学观察结果表明，它的体细胞染色体数目2n=56的植株占77.3%，花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ2n=28Ⅱ的细胞占59.95%，其染色体构型为1.43 Ⅰ+27.48Ⅱ+0.09Ⅲ+0.04Ⅳ。同工酶电泳结果表明，它的酯酶比双亲(普通小麦和天蓝偃麦草)多出5条新生酶带，同时又缺少双亲分别具有的3条酶带,进一步证明了利用外源种质与小麦遗传背景之间相互作用产生新性状的可能性。     

普通小麦背景中长穗偃麦草高分子量麦谷蛋白基因的表达、染色体定位与分子标记

摘要：以普通小麦（Triticum aestivum）中国春、长穗偃麦草?穴Thinopyrum elongatum ?雪及其双二倍体、二体异附加系、二体异代换系为材料，采用SDS-PAGE分析了种子高分子量麦谷蛋白亚基。长穗偃麦草高分子量麦谷蛋白基因在中国春背景中编码一条高分子量麦谷蛋白亚基，其迁移率与中国春1By8亚基相同，命名为1E8亚基，控制该亚基的基因位点Glu-E1位于长穗偃麦草E组染色体第一同源群的长臂上。用高分子量麦谷蛋白y亚基基因重复区域的特异引物进行扩增，长穗偃麦草1E8亚基编码基因（Glu-E1）扩增出1 300 bp的片段，而中国春1By8亚基编码基因（Glu-B1y）扩增出1 950 bp的片段。     

巴西橡胶树第9染色体的显微分离及微克隆文库的构建

橡胶是我国的重要的战略物资,深入研究橡胶树基因组具有重要意义。本实验以巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)热研7-33-97幼叶为材料,采用酶解去壁低渗法制片,玻璃针显微分离法成功分离出橡胶树单染色体。单染色体经蛋白酶消化、Sau3A核酸内切酶酶切和两轮LA-PCR(接头连接PCR)扩增。得到250~2000bp之间的DNA片段,通过Southernblot对单染色体产物进行验证,结果表明扩增片段与巴西橡胶树基因组DNA之间有同源性。从而说明单染色体DNA已被成功的扩增。采用荧光原位杂交技术(fluorescence insitu hybridization,FISH)验证分离出的是第9号染色体,构建了橡胶树第9号染色体微克隆文库。克隆片段长度在300~1200bp,平均为650bp左右,文库包含48000个克隆,空载率为1%。本研究从巴西橡胶树单染色体入手,运用单染色体微分离、微克隆技术,构建了巴西橡胶树单染色微克隆文库,为橡胶树基因组研究提供了新的思路与方法,为更好地开展橡胶树分子辅助育种提供技术方法。     

杀配子染色体诱导小麦染色体畸变及其后代的细胞遗传学研究

本研究利用形态学和分子细胞遗传学研究方法对中国春-长穗偃麦草二体附加系与中国春-柱穗山羊草(2C)二体附加系的杂交后代F1、F2、F3进行研究,旨在探讨杀配子染色体诱导小麦-外源染色体畸变的频率,为小麦遗传育种提供材料基础。结果表明,杀配子染色体(2C)的丢失与恢复成二体,造成杂种F1、F2的减数分裂行为异常,杂种F3较前2代单价体数明显下降,相对紊乱系数明显低于F2。同时,杀配子染色体连续2次作用,使得附加系中ABDE染色体组受到严重影响,部分染色体产生缺失和易位,在后代传递中易于丢失,而外源E组染色体片段渗入到小麦染色体组中,使得染色体配对异常,产生非理论值的单价体数,导致后代育性下降或败育。本研究共检测F3植株448株,得到易位24株,缺失36株,小麦间易位19株,易位频率为5.36%,缺失频率为8.04%,染色体畸变总频率为13.39%。断裂位点的分布比率依次为:B组A组D组。本研究表明,杀配子染色体诱发染色体畸变频率高,且具有一定的方向性,是创造小麦遗传育种新材料的重要途径。     

辐射诱导荆州黑麦染色体1R结构变异的研究

以60Co γ射线(12Gy)辐照普通小麦辉县红-荆州黑麦染色体1R二体添加系花粉,并授粉给辉县红,获得153粒辐射杂种M₁代种子。以Fluorescein-12-dUTP标记的荆州黑麦基因组DNA为探针,对其中33粒M₁代种子根尖细胞有丝分裂中期染色体进行GISH(genomic in situ hybridization)分析发现,23粒种子中的荆州黑麦1R染色体未发现明显变化,而另外10粒均发生了小麦和黑麦染色体易位,变异率为30.30%。电离辐射诱发产生的易位类型包括相互易位、大片段易位、小片段易位、整臂易位及端体等。这些易位染色体涉及1R染色体11个易位断点,其中位于长臂4个,短臂6个,位于着丝粒区1个,说明电离辐射可有效诱发目标染色体系列结构变异,为染色体缺失作图、重要性状基因定位和培育仅具目标基因的小片段易位提供了可能。     

EMS诱导小麦易位系YW642突变体的鉴定与分子标记分析

抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642携带中间偃麦草抗黄矮病基因Bdv2。用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）处理抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642的种子6000粒,从M2中筛选出32类不同性状的突变体73株,表型变异率约为7.38%。对感黄矮病突变体的M3、M4代继续进行鉴定,证明18个感黄矮病突变体的突变...     

小麦中国春背景下长穗偃麦草Ee染色体组特异AFLP及STS标记的建立

为建立长穗偃麦草Ee染色体组特异的分子标记,以普通小麦中国春、中国春-长穗偃麦草二体代换系、附加系为材料,用5对AFLP引物进行分析,共筛选出28个分布于1Ee-7Ee 7个染色体特异的AFLP标记,经PAGE凝胶电泳后回收、克隆和测序,并根据测序结果设计PCR特异引物,成功地将AFLP标记E-ATC/M-CGTA341bp, E-ATT/M-CTAG265bp, E-AAT/M-CCAG139bp和E-ATT/M-CTAG205bp转化为实验结果稳定、操作更简单的STS标记。利用获得的STS标记对5个长穗偃麦草居群和8个小麦品种进行了鉴定。结果表明其可以在长穗偃麦草居群中被检测到,但在其它小麦背景中检测不到。表明这些标记可以用于小麦-长穗偃麦草异源附加系和代换系中长穗偃麦草遗传物种的检测。     

长穗偃麦草y型高分子量谷蛋白基因的鉴定与分子克隆

采用SDS-PAGE方法，对长穗偃麦草(Elytrigia elongata，EeEe，2n=2x=14)的高分子量谷蛋白进行了研究。在长穗偃麦草材料P198526中，33粒种子具有2～4条各不相同的高分子量谷蛋白亚基，以4条最为普遍，这表明长穗偃麦草居群P198526高分子量谷蛋白位点上是杂合的。采用1粒种子总DNA对其蛋白基因编码区进行PCR扩增，有2．4、2．1、1．8和1．5kb4个片段，分别回收并克隆到T-载体上，得阳性质粒pEe2．4，pEe2．1，pEe1．5和pEe1．8。其中，pEe1．5和pEe1．8为两个y型亚基，与小麦族物种A、B、D和R基因组编码的y型高分子量谷蛋白基因十分类似。这进一步证实了长穗偃麦草含有高分子量谷蛋白基因。     

长穗偃麦草逆境诱导cDNA文库的构建和初步鉴定

长穗偃麦草是小麦的野生近缘植物之一,具有抗多种生物胁迫和非生物胁迫的优良基因。为了从中发掘耐盐基因,分别用100、200、300、400 mmol·L~(-1)的Na Cl和20%、30%、50%(w/v)的PEG-6000处理长穗偃麦草幼苗,采用改良的SMART方法合成逆境诱导条件下的全长c DNA。采用Gateway技术中的BP反应构建长穗偃麦草全长入门c DNA混合文库,滴度为4.0×106cfu·m L~(-1),库容量为2.0×107cfu,插入片段平均长度为0.75 kb,重组率达98.9%。将该入门文库重组到植物转基因双元载体p MDC83中,获得目标文库,其原始滴度为6.0×106cfu·m L~(-1),库容量为3.0×107cfu,插入片段平均长度为0.45 kb,重组率达100%。通过农杆菌侵染萌发花粉再授粉的方法,获得转基因玉米T0种子,转化率达3%;用农杆菌侵染法将农杆菌与烟草BY-2细胞共培育,成功将目标文库转入到烟草BY-2细胞中,在培养基中加入潮霉素和不同浓度的Na Cl溶液,筛选获得耐盐细胞系69个。研究结果为大规模快速筛选鉴定植株水平和细胞水平上的抗盐基因奠定了基础。