荷斯坦牛DRA基因多态性及序列特征分析

为探讨荷斯坦牛DRA基因的多态性及序列特征,本研究采用基因组DNA混合池扩增并直接测序的方法对荷斯坦牛DRA基因编码区进行多态性分析,同时利用生物信息学方法预测DRA基因的理化特性及其编码蛋白的高级结构。结果表明,荷斯坦牛DRA基因编码区上有4个碱基突变,包含1个错义突变和3个同义突变。DRA基因共编码253个氨基酸,编码产物是一种稳定的不可溶蛋白,具有15个潜在的磷酸化位点,二级结构为混合型,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。本研究结果为荷斯坦牛的疾病相关基因筛选和抗病分子育种提供了一定的理论依据。     

薄壳山核桃CiSULTR2.1基因的克隆与表达分析

为探究薄壳山核桃CiSULTR2.1基因功能及表达特征,以一年生薄壳山核桃实生苗为材料,利用RT-PCR和PCR技术克隆CiSULTR2.1基因全长,利用RT-qPCR技术分析其在不同浓度硒酸盐处理下的表达情况。结果表明,克隆得到1 902 bp的序列,经分析此序列属硫转运蛋白基因CiSULTR2.1全长开放阅读框的cDNA,编码633个氨基酸。CiSULTR2.1蛋白分子质量为68 943.37 Da,为疏水性的非分泌蛋白,无信号肽,结构稳定,二级结构主要由α-螺旋(51.18%)、延伸链(12.64%)和无规则卷曲(31.28%)构成,包含硫转运蛋白典型的Sulfate-transp结构域(PF00916)和STAS结构域(PF01740)。RT-qPCR分析结果表明,CiSULTR2.1在薄壳山核桃幼苗根与叶中均有表达,40、80 μmol·L^-1硒酸盐处理下,12 h出现表达高峰,此后表达量明显下降;而0.5 μmol·L^-1硒酸盐处理下,CiSULTR2.1表达高峰出现时间延后至48 h。硒酸盐浓度过高时,CiSULTR2.1表达量显著下降且低于对照。CiSULTR2.1基因能够快速响应40、80 μmol·L^-1高浓度硒酸盐的诱导,而0.5 μmol·L^-1低浓度硒酸盐需要较长时间才能诱导其高表达。高浓度硒酸盐处理较长时间对植物产生毒性效应,植物对硒酸盐的吸收减少,硒含量降低。本研究结果为薄壳山核桃CiSULTR2.1基因功能及硒吸收机制的研究提供了理论依据。     

巴哈雀稗PnDREB2基因克隆及时序表达图谱构建

脱水反应元件结合蛋白(DREBs)在植物非生物逆境胁迫中可调节下游一系列抗逆基因的表达。为探究巴哈雀稗DREB2基因在逆境胁迫下的功能,本研究采用RNA-Seq结合RT-PCR技术从巴哈雀稗中获得一个DREB2基因CDS区全序列,命名为PnDREB2(GenBank登录号:MH150946)。核苷酸序列分析表明,该基因开放阅读框全长774 bp,编码257个氨基酸,相对分子质量为28.09 kD,理论等电点为5.25;该植物蛋白中具有DREB类基因家族典型的保守域AP2结构域,属于DREB2类转录因子A类中A2亚类的亚型1。进化和聚类分析结果表明,巴哈雀稗PnDREB2基因与高粱、割手密、玉米、谷子及牛鞭草亲缘关系较近,氨基酸序列同源性分别为91.10%、89.50%、88.20%、87.60%和87.60%。RT-qPCR和生物信息学分析表明,PnDREB2基因在茎中表达量最高,幼穗次之,叶最低;表达产物定位于细胞质中,具有26个磷酸化位点,并具有结构和功能的特异性。PnDREB2表达量受干旱(PEG-6000,20%)和高温(40℃)的强烈诱导,同时也受到高盐(NaCl,300 mmol·L^-1)、低温(4℃)、脱落酸(ABA,100 μmol·L^-1)和赤霉素(GA,100 μmol·L^-1)等非生物胁迫和激素的不同程度诱导,随着处理时间的延长,整体上均呈先增加后降低的趋势。本试验为巴哈雀稗抗逆分子机理研究与抗性增强的转基因材料培育奠定了理论基础。     

脱落酸对番茄部分果实性状和营养品质的影响

为研究脱落酸(ABA)对番茄果实品质的影响,本研究测定了番茄ABA生物合成缺失突变体not和flc及其野生型各成熟时期果实,以及外源100 μmol·L^-1 ABA处理后不同天数的番茄果实的外观品质和营养品质。结果表明,内源ABA缺失抑制番茄果实增重并促进果实纵向生长,但对果实硬度无明显影响。同时,内源ABA可影响番茄果实可溶性固形物含量并促进破色期和转色期的还原糖积累。not和flc果实中番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素和总类胡萝卜素含量均显著高于其野生型,且外源喷施试验表明,与对照组相比,外源100 μmol·L^-1 ABA处理能显著抑制番茄果实中番茄红素、β-胡萝卜素和总类胡萝卜素的积累。综上,ABA在调控番茄果实外观品质方面,可促进番茄果实增重并抑制番茄果实纵向生长;在调控番茄果实营养品质方面,可促进还原糖积累并抑制类胡萝卜素积累。本研究结果为利用ABA调控番茄果实品质提供了一定的理论依据和技术支持。     

体外消化对油茶蒲提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响

为探索体外消化对油茶蒲活性成分的影响,本试验以油茶蒲为原料,分析消化前后油茶蒲提取物、水相、正丁醇相、乙酸乙酯相对α-葡萄糖苷酶抑制活性的变化,采用高效液相色谱(HPLC)、分子对接进一步探索油茶蒲中抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性物质。结果表明,油茶蒲提取物、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀为0.27~1.17 μg·mL^-1,经体外模拟消化后,IC₅₀上升至0.34~2.36 μg·mL^-1,其中乙酸乙酯相的活性最强。油茶蒲提取物成分分析结果显示,体外消化能影响各相萃取物的总酚含量,其中乙酸乙酯相的总酚含量最高(44.49 μg·mL ^-1)且在体外消化中具有良好的稳定性。相关性分析结果表明,油茶蒲提取物中有5个化合物与α-葡萄糖苷酶的IC₅₀呈显著相关,其中包括3-O-甲基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(MEAG)。AutoDock分子对接结果也表明,MEAG具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,以及最佳的结合能(-7.99 kcal·mol^-1)和估计抑制常数(1.40 μmol·L ^-1), 其主要通过氢键和疏水作用与α-葡萄糖苷酶的氨基酸残基相互作用。本研究结果为开发新型α-葡萄糖苷酶抑制剂以及油茶蒲资源利用提供了数据参考。     

羊栖菜组分多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

为高效利用羊栖菜组分多糖(SFPSⅠ),以SFPSⅠ为原料,α-葡萄糖苷酶作为靶标,研究SFPSⅠ对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其结构的影响,建立具有α-葡萄糖苷酶活性的Caco-2细胞模型,并对Caco-2细胞模型上α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果进行研究。结果表明,SFPSⅠ对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用,使得α-葡萄糖苷酶活力下降一半时的抑制剂浓度,即半抑制(IC₅₀)为0.31 mg·mL^-1。SFPSⅠ对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是一个可逆过程,抑制类型为混合型抑制。动力学分析结果表明,SFPSⅠ对α-葡萄糖苷酶的抑制常数(K_i)为0.143 μmol·L^-1。荧光测定结果表明,SFPSⅠ结合会引起α-葡萄糖苷酶三级结构的明显变化。随着SFPSⅠ浓度的升高,其对Caco-2细胞模型上α-葡萄糖苷酶抑制效果越好。本研究结果为进一步探讨和设计新型α-葡萄糖苷酶抑制剂奠定了科学基础,同时也为开发具有降血糖功能的功能性药品与保健品提供了新资源。     

酉州乌羊MC1R基因的克隆鉴定、生物信息学及多态性分析

MC1R是影响皮肤色素沉着中黑皮素系统的重要基因,通过信号分子的相互作用影响黑色素的生成。为探究酉州乌羊 MC1R的生物学特性,本研究对酉州乌羊MC1R进行了分离鉴定、生物信息学分析。结果表明,酉州乌羊皮肤组织MC1R基因的CDS序列为954 bp,共编码317个氨基酸,酉州乌羊与各物种MC1R具有较高同源性。酉州乌羊MC1R编码蛋白的分子式是C₁₆₀₃H₂₅₆₅N₄₁₁O₄₁₀S₂₂,其为疏水蛋白,有7个α-螺旋组成的跨膜结构域和3个保守功能结构域,MC1R氨基酸序列大部分都用于构成α-螺旋。此外,酉州乌羊MC1R基因c.676A>G突变,其编码的氨基酸由赖氨酸转变为谷氨酸,位于受光刺激和G蛋白配体结合的保守结构域上,氨基酸的异义替换还造成了酉州乌羊MC1R空间构象的差异。而对重庆市山羊群体多态性检测发现,山羊MC1R基因c.676A>G变异位点在重庆合川白山羊、巫溪白山羊、本地白山羊、酉州乌羊中共享,且c.676A>G位点的各基因型在皮肤白色和乌色山羊群体中的分布差异不显著(P>0.05)。本研究初步揭示酉州乌羊MC1R的序列特征和蛋白结构,为酉州乌羊MC1R影响皮肤色素沉积的分子机制研究提供了理论数据。     

高粱转录因子SbWRKY71基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究通过基因克隆的方法,从高粱BTx623中克隆得到一个WRKY转录因子基因(SbWRKY71),该转录因子基因全长1 335 bp(phytozome登录号:Sb04g005520),编码364个氨基酸,分子量为38.95 kDa;预测该转录因子定位于细胞核,具有WRKY转录因子典型的保守结构域,且该蛋白属于WRKY蛋白家族的第Ⅱ组成员。系统进化树分析表明,高粱SbWRKY71氨基酸序列与禾本科作物玉米ZmWRKY71的亲缘关系最近,为75%;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测表明,SbWRKY71基因表达具有组织特异性,在叶中表达丰度最高,茎中最低。经激素水杨酸(SA,1 mmol·L^-1)、吲哚-3-乙酸(IAA,10 μmol·L^-1)和脱落酸(ABA,200 μmol·L^-1)处理后,SbWRKY71的表达量呈现先下降后升高再下降的趋势;在γ-氨基丁酸(GABA)和甘露醇(D-Mannitol,300 mmol·L^-1)模拟干旱胁迫以及氯化钠(NaCl,250 mmol·L^-1)盐胁迫处理下,SbWRKY71的表达量均先升后降,分别在3、6和9 h达到最大值;高粱经病原相关分子模式(PAMPs)flg22(100 nmol·L^-1)、翻译延长因子(elf18,100 nmol·L^-1)处理后,SbWRKY71表达均受到抑制,但在几丁质(Chitin,8 nmol·L^-1)处理下,SbWRKY71受到诱导表达。本研究为进一步探索SbWRKY71基因在调节高粱抗性、响应激素以及逆境胁迫应答等过程中的作用机制提供了基础。     

番茄2个ERF-B1亚族转录因子基因的克隆及其对生物和非生物胁迫响应

为进一步研究番茄ERF转录因子调控植物抗逆的分子机理,本研究以番茄浙杂-301为试验材料,分别克隆获得2个乙烯反应元件结合蛋白基因SlERF83和SlERF109,并对其进行序列及表达分析。结果表明,番茄SlERF83和SlERF109基因分别含有678 bp和669 bp的开放阅读框,编码225和222个氨基酸,各含有1个保守的AP2结构域,属于亲水性蛋白。进化分析表明,这2个ERF转录因子均属于AP2/ERF家族中ERF亚族的B1组。SlERF83和SlERF109三级结构都含有1个α-螺旋和3个β-折叠。酵母单杂交及β-半乳糖苷酶活性测定结果证明SlERF83转录因子可以与GCC-box结合。番茄2个ERF蛋白启动子含有多种逆境相关的顺式作用元件。采用荧光定量PCR检测SlERF83和SlERF109在非生物和生物胁迫下的表达,结果表明,高盐和干旱胁迫下,SlERF83和SlERF109基因的表达均被抑制;水杨酸处理能够诱导SlERF83和SlERF109基因的表达;茉莉酸甲酯处理下SlERF83表达水平提高,SlERF109表达量降低;番茄黄化曲叶病毒侵染下,SlERF83和SlERF109基因的表达均被抑制。SlERF83和SlERF109转录因子可能参与了番茄对生物及非生物胁迫的响应过程。本研究结果为进一步深入开展ERF转录因子调控番茄抗逆分子机制研究提供了一定的理论依据。     

γ-氨基丁酸对低温胁迫下桃果实蔗糖代谢的影响

为探讨γ-氨基丁酸(GABA)对低温胁迫下桃果实蔗糖代谢的影响,以湖景蜜露品种水蜜桃为试验试材,采用5 mmol·L^-1外源GABA和100 μmol·L^-1 GABA-T抑制剂(VGB)处理桃果实,比较分析水蜜桃出汁率、GABA含量、可溶性糖含量、蔗糖代谢中间产物以及蔗糖代谢相关酶基因的变化。结果表明,外源GABA处理和GABA复合VGB处理通过提高桃果实贮藏后期内源GABA含量和蔗糖含量,从而有效抑制桃果实在低温贮藏期间冷害的发生。此外,外源GABA处理抑制了贮藏后期蔗糖降解相关酶基因PpSUS5的表达,减缓了桃果实中蔗糖含量的降低速率,从而提高了果实抗冷害的能力。外源GABA复合VGB处理增强了贮藏后期蔗糖合成相关酶基因PpSPS1、PpSPP1和PpSUS3的表达,从而维持桃果实较高的蔗糖含量,抑制果实冷害发生。本研究结果为桃果实采后贮藏保鲜提供了理论依据。     

山羊雌激素受体(ESR)基因部分外显子多态性分析

雌激素受体(estrogen receptor,ESR)与雌激素专一性地结合,并通过与雌激素的相互作用来调节生殖机能相关基因的表达,在动物繁殖中起着重要作用。研究采用PCR-SSCP和测序方法分析ESR基因外显子1、4在部分山羊(Capra hircus)品种中的单核苷酸多态性,并研究该基因对山羊繁殖力的影响。结果表明：ESR基因外显子1、4在所检测的济宁青山羊、波尔山羊、安哥拉山羊和内蒙古绒山羊中均不存在多态性;山羊扩增片段核苷酸和氨基酸序列与人、牛、猪、马、绵羊、大鼠、小鼠和鸡8个物种的同源性分别为51.3%～97.3%和64.5%～98.3%;山羊ESR基因氨基酸序列存在2处特有突变,分别是外显子1第81位插入一个脯氨酸(P)和外显子4第4位由天冬氨酸突变为天冬酰胺(D4N)。哺乳动物ESR基因外显子1、4序列保守性强,该区域可能不是影响山羊高繁殖力的功能结构域。     

外源NO对镉胁迫下草地早熟禾种子萌发及幼苗生理特性的影响

为探究可缓解草地早熟禾镉胁迫的最适有效硝普钠(SNP)浓度,以草地早熟禾品种蓝月为试验材料,SNP为NO供体材料,研究不同浓度NO对镉胁迫下草地早熟禾叶片生理特性的影响。结果表明,镉离子浓度为200 μmol·L^-1时草地早熟禾的生长受到严重抑制,施加SNP(<100 μmol·L^-1)能够促进草地早熟禾种子发芽,增加草地早熟禾幼苗叶绿素含量,提高叶片干物质量、相对含水量,以及叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,而其游离脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量均有所降低。表明低浓度NO(<100 μmol·L^-1)可有效缓解草地早熟禾镉胁迫,高浓度SNP(>100 μmol·L^-1)则表现出抑制作用。本研究结果为草地早熟禾修复镉污染土壤提供了理论依据。     

2种雀稗属牧草对低磷胁迫的生长、生理应激响应

为比较宽叶雀稗(Paspalum wettsteinii)和巴哈雀稗(Paspalum notatum)适应低磷胁迫的能力,揭示其对低磷胁迫的形态及生理响应机理,试验以石英砂为基质,定期浇灌200 μmol·L^-1(常磷)、20 μmol·L^-1、 2 μmol·L^-1的Hoagland营养液模拟低磷胁迫处理,分别在磷处理10、20、30 d时测定供试材料的幼苗形态及生理特性。结果表明,低磷处理30 d时,2种雀稗属牧草地上部生物量、株高、叶面积、叶长呈降低趋势,根干重、根冠比、总根长、根尖数、根毛数量较常磷处理增加,超氧化物歧化酶(SOD)(除巴哈雀稗)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)活性较常磷处理显著增加(P<0.05),根部电导率、叶片电导率较常磷处理显著提高(P<0.05)。当磷水平降低至2 μmol·L^-1时,宽叶雀稗地上部生物量降幅最大,为41.67%,根冠比、SOD活性增幅最大,分别为86.36%、113.19%;巴哈雀稗叶长降幅最大,为90.43%,根冠比、根毛数量增幅最大,分别为108.47%和74.91%。综上,低磷胁迫抑制了2种雀稗属牧草地上部的生长,促进了地下部的生长,提高了保护酶活性,且宽叶雀稗的低磷适应能力高于巴哈雀稗。本研究为2种雀稗属牧草在低磷环境下的栽培提供了理论依据。     

草莓叶主要挥发性物质的测定及其对草莓球腔菌的抑菌效果

为探究草莓叶片中挥发性物质对草莓球腔菌的抑菌作用,本研究测定了草莓叶片中主要挥发性物质,并以草莓球腔菌为处理对象,研究草莓叶片主要挥发性物质对其孢子萌发、菌丝生长以及线粒体膜电位的影响。结果表明,草莓叶片挥发性物质中的萜类化合物主要组分为芳樟醇、桃金娘烯醇,C6醛类化合物主要组分为己醛、2-己烯醛、反式-2-己烯醛、顺式-3-己烯醛等。当芳樟醇、桃金娘烯醇浓度为50 μL·L^-1,己醛浓度为5 μL·L^-1, 反式-2-己烯醛浓度为0.5 μL·L^-1,顺式-3-己烯醛浓度为5 μL·L^-1 熏蒸处理草莓球腔菌时,能显著抑制病原菌孢子的萌发和菌丝生长,并能使病原菌线粒体膜电位下降,从而抑制草莓球腔菌的生长且对草莓叶片无明显损伤。研究表明利用适宜浓度的芳樟醇、桃金娘烯醇、己醛、反式-2-己烯醛、顺式-3-己烯醛熏蒸处理,能够有效抑制草莓球腔菌的生长。本研究为研制新型天然植物病害抑菌剂提供了依据。     

山羊美臀突变基因（CLPG）的多态性鉴定及其与生产性能的关系

Callipyge绵羊的臀部肌肉明显肥大,呈极性超显性遗传。研究克隆了山羊（Capra hircas）美臀突变基因(CLPG) 250 bp的序列(GenBank登录号：EU753362), 对其多态性及其与山羊生产性能的关系进行了分析。结果表明,所扩增片段与绵羊和猪相应片段的同源性分别为96.04%和88.65%。PCR-SSCP分析表明,在该DNA区段存在多态性。测序结果显示,在对应于绵羊（Ovis aries）的CLPG基因没有发现A→G的突变,但在该位点下游147 bp处检测到一个A→C的颠换,记为SNP216。对波尔山羊(n　=63)、莱芜黑山羊(n　=70)、鲁波杂交山羊(n　=40)、鲁北白山羊(n　=29)和内蒙古阿拉善白绒山羊(n　=115)共5个群体的多态性进行了检测,结果表明：除鲁北白山羊以外,A等位基因均为优势等位基因;波尔山羊、莱芜黑山羊、鲁北白山羊和鲁波杂交山羊群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P　＞0.05）,而内蒙古阿拉善白绒山羊群体显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P　＜0.01）;不同基因型的内蒙古阿拉善白绒山羊的初生重、从出生到断奶时的增重及产绒量的最小二乘均值差异不显著（P　＞0.5）。     

蓝莓果实黑斑病的病原鉴定及植物精油抑菌研究

为明确山东泰安产区蓝莓采后黑斑病病原菌,通过传统真菌形态学、rDNA-ITS 序列分析,结合构建系统进化发育树,鉴定该病原菌为链格孢菌(Alternaria alternata)。选用肉桂皮、百里香、丁香、柠檬草和玫瑰草5种植物精油对A. alternata进行熏蒸抑菌试验,通过体外抑菌活性筛选出最优的精油类别和作用浓度。体外抑菌结果表明, 5种植物精油对链格孢菌均有不同程度的抑菌活性。其中,肉桂皮精油对A. alternata的抑菌效果最好,其最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC) 分别为 0.03 μL·mL^-1和0.06 μL·mL^-1。体内接种抑菌试验发现,0.03 μL·mL^-1肉桂皮精油可有效降低蓝莓果实的发病率。扫描电子显微镜(SEM)结果表明,对照组菌丝光滑平整,而经肉桂皮精油处理组,菌丝表面形态受到严重破坏,出现粗糙、褶皱等变形现象。本研究可为山东产区蓝莓贮藏期黑斑病的预防和绿色控制提供一定的参考依据。     

高亲和力大豆凝集素单抗制备及免疫学特性鉴定

为制备高亲和力的大豆凝集素(SBA)单克隆抗体,本试验以50 μg SBA蛋白/200 μL乳化液/只的剂量免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和灵敏性。选择血清效价和灵敏性较好的小鼠进行细胞融合。通过有限稀释亚克隆筛选出能稳定分泌SBA单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法批量制备SBA单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,SBA免疫的4只小鼠中,1号小鼠效价最高且灵敏性最好,半数抑制浓度(IC₅₀)为571.4 μg·L^-1。选取该小鼠进行细胞融合,并最终得到1株杂交瘤细胞,命名为5B4E10。制备的SBA单克隆抗体的效价达到1∶409 600 以上,IC₅₀为82.04 μg·L^-1,亚型为IgG1型,亲和力常数(Ka)为1.83×10⁹ L·mol^-1。且该抗体与大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和其他抗营养因子无交叉反应。本研究结果为建立大豆及其制品中SBA的免疫学检测方法奠定了良好的抗体基础。