杭州地区甘蔗花叶病病原鉴定

从杭州田间表现典型花叶症的甘蔗病叶中得到病毒分离物SC－ZJ，按照SCMV亚组中甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV)，玉米矮花叶病毒（Maize dwarf mosaic virus,MDMV)、高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus,SrMV)、约翰逊草花叶病毒（Johnsongrass mosaic virus,JGMV)等4种病毒基因组序列设计特性引物，对SC－ZJ进行IC－RT－PCR扩增，结果用SrMV特异性引物扩增到1条长约1.1kb的片段，而用其它3种病毒特异性引物扩增不出任何片段。扩增片段经克隆后测定序列，序列包含1135核苷酸（nt)，编码378个氨基酸（aa），取其中的近全长外壳蛋白（CP）氨基酸序列（312aa)，与SrMV、MDMV,SCMV,JGMV等4种病毒对应的序列进行同源性比较，结果核苷酸序列同源性依次为95．3％、75．2％、61．2％和53．6％，氨基酸序列同源性依次为97．1％、78．1％、72．9％和56．2％，根据IC－RT－PCR扩增鉴定及序列同源性比较结果，将SC－ZJ鉴定为SrMV。并根据CP氨基酸序列的同源性进一步分析了4种病毒的亲缘关系。     

人参果主要病毒检测方法研究

为了给人参果病毒检验及抗病性研究提供支持,对人参果采用ELISA和RT-PCR两种检测方法对8份田间材料中的马铃薯M病毒(PVM)、番茄花叶病毒(ToMV)和烟草花叶病毒(TMV)进行检测,对比筛选病毒检测方法。结果表明,ELISA法检测PVM的阳性检出率为87.5%;ToMV为37.5%,疑似率为12.5%;TMV为37.5%。通过RT-PCR检测体系,从人参果样品中分别扩增出与试验设计大小相符的特异条带,PVM阳性检出率为100%,ToMV为 50.0%,TMV为37.5%,检测灵敏性和准确性更高,检测结果符合率在87.5%以上。对扩增阳性产物进行凝胶回收测序,确定为目标条带。     

埃及伊蚊免疫应答相关基因mapk-like的dsRNA原核表达及其饲喂后表达水平的变化

mapk-like是一种信号转导相关促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因,与线虫(Caenorhabditis elegans)中参与抵御Cry毒素的p38 MAPK含有类似的模序,其是否参与埃及伊蚊(Aedes aegypti)抵御苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)过程有待验证。为简便并大量获得RNAi验证所需的dsRNA,本研究利用RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli) HT115高效和廉价的优点,根据已测序的促有丝分裂激活蛋白激酶家族基因mapk-like基因序列,设计特异性引物,PCR扩增大小为361 bp的目的片段mapk-like (GenBank登录号：AAEL003728-RA),将其连接到克隆载体pMD18-T上,利用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ将其插入到原核表达载体pLitmus28i的2个T7启动子之间,成功构建可诱导形成目的双链RNA (dsRNA)的原核表达重组载体pLitmus28i-mapk-like,并转化大肠杆菌HT115,经IPTG诱导,1 mL菌液的dsRNA产量可达1.18μg,电泳检测条带清晰,质量良好。此外,利用壳聚糖包裹dsRNA形成纳米微粒,上清经电泳检测表明,壳聚糖的聚沉效率良好,纳米微球可有效防止dsRNA从饲料琼脂块中游离出来,提高dsRNA的稳定性。埃及伊蚊幼虫摄取mapk-like基因的dsRNA后,相对转录表达水平为65.55%,表达量明显下调,饲喂效果良好。研究结果将有利于进一步筛选获得相关抵御基因,为建立一个基于RNA沉默防治蚊媒病的研究体系提供了基础资料。     

黄瓜抗西瓜花叶病毒性状的序列特征性扩增区域(SCAR)标记

以抗西瓜花叶病毒 (Watermelon mosaic virus, WMV)的黄瓜（Cucumis sativus）品种秋棚和感该病毒的欧洲八号为亲本,构建了120个F6重组自交系群体。根据苗期抗病接种鉴定结果进行遗传分析,发现黄瓜抗WMV的基因是由隐性单基因控制。利用集团分离分析法和相关分子标记技术,获得的特异片段E-ACT/M-CTT-427与WMV的抗性基因连锁,连锁距离为8 cM。双亲差异片段测序结果显示感病亲本目标片段存在6个T碱基的缺失。根据测序结果设计了1对与目的基因遗传距离为8 cM的序列特征性扩增区域(SCAR)引物,该引物可用于黄瓜抗WMV病毒的分子标记辅助育种。     

侵染上海番茄的黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的~(32)P分子标记杂交检测及分子鉴定

2004和2005年夏季,在上海郊区露天栽培的番茄地出现典型的病毒病危害,并造成严重的产量损失。分别以32P标记的CMV基因组RNA3部分序列和卫星RNA的cDNA探针对自然感病的番茄叶组织和提纯的病毒粒子中提取的总RNA进行杂交检测,确定以上植物组织和病毒粒子中均具有CMV及卫星RNA。dsRNA分析确定自然感病叶组织中具有典型黄瓜花叶病毒(CMV)基因及其卫星RNA条带。以常规引物对感病植物的总RNA进行RT-PCR扩增,获得CMV RNA3全长克隆,经测序显示该RNA3序列属于CMV亚组Ⅱ;通过在卫星dsRNA两端分别加上15nt的单链DNA接头,以接头互补序列为引物进行扩增获得一个383nt的卫星RNA的全长序列。同源性分析结果显示其与已报道的CMV卫星RNA同源性为72.6%~99.5%,但其3′末端存在多个碱基的突变。根据同位素杂交检测及分子鉴定,CMV及其卫星RNA变异类型在上海自然感病番茄上发生和普遍存在,可能对病害流行和新的症状出现产生影响。     

苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因在白三叶中的表达及转基因植株的抗病性分析

以白三叶(Trifolium repens L.)的两个品种Irrigation和Huia的子叶为转化体，用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将外源的苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因转入白三叶，经过筛选、分化和再生，得到了具有卡拉霉素抗性的再生植株。对这些植株进行PCR、Southern和Northern分析，结果表明，外源目的基因已经整合到白三叶基因组中并且得到了表达。对Northern分析呈阳性的植株进行了抗病性检测，证明表达苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因的植株病症减轻，发病率、病情指数及病毒积累量都明显低于对照，有的甚至不表现症状，达到了免疫的程度。     

ToMV番茄坏死株系农杆菌侵染性克隆构建及其表达

番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的典型成员,该病毒侵染严重影响农作物的产量和质量。ToMV-N5株系能引起番茄(Lycopersicon esculentum)主栽品种(合作903)系统性坏死,建立该株系的侵染性克隆体系是研究其致病机理的必要条件。本研究将ToMV-N5株系的基因组克隆至含35S启动子瞬时表达载体pCB301中,农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)浸润接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)和番茄结果表明,农杆菌侵染性克隆pCB301-ToMV-N5引起本氏烟和番茄系统性坏死症状,与其病毒粒子摩擦接种所引起的症状相一致。以绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)代替ToMV-N5的外壳蛋白基因(coat protein,CP)获得表达载体pCB301-ToMV-N5CP45GFP,病毒接种结果表明,ToMV-N5能高效表达GFP,在病毒浸润接种浓度(OD600)为0.002时,GFP也能够有效表达。pCB301-ToMV-N5CP45GFP缺失了CP基因使得病毒不能系统性侵染,将烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)U5株系包含CP大小为647 nt(nt 5 498~6 145)片段克隆到pCB301-ToMV-N5CP45GFP中,获得pCB301-ToMV-N5CP45GFP-CPU5,浸润接种本氏烟结果表明,病毒能长距离移动,在寄主非接种部位表达GFP;浸润及摩擦接种番茄结果表明,只能在显微镜下观察到微弱GFP,且局限于接种部位。本研究成功获得了ToMV-N5株系的农杆菌侵染性克隆及其表达载体,为研究该病毒侵染的分子机理提供了基础资料。     

反转录—多聚酶链式反应（RT—PCR）快速检测两种大麦土传黄花…

大麦黄花叶病毒和大麦性花叶病毒是由土壤真菌传播并引起大麦黄花叶症状的两种重要病原病毒，用常规方法较难区分这两种不同的病毒。我们以江苏如东、杨州等地的大麦病苗为材料，利用反转录－多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，成功地扩增出了两病毒ＲＮＡ－１ ３‘端区域的１．１ｋｂ左右的特异性片段，建立了这两种病毒的ＲＴ－ＰＣＲ快速检测方法，并对利用ＲＴ－ＰＣＲ技术对该两病毒害进行早期快速诊断的实用性进行了探讨。     

双重一步法RT-PCR同时检测兰花上的两种主要病毒

兰花栽培主要通过分株或组织培养进行无性繁殖，所以兰花病毒病具快速远距离传播和逐代加重的特点。对种苗及贸易商品(盆花及组培瓶苗)进行病毒检测是兰花病毒病防治的根本性措施。在兰花上分离到的病毒超过25种，但危害最重和分布最广的是建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)。目前兰花病毒检测通常采用血清学方法，     

RNA干扰V1和C1提高番茄植株对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗性

为了获得高抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)番茄材料,本研究通过人工设计以TYLCV病毒基因V1、C1为靶标的双链RNA(dsRNA),通过农杆菌介导法转化番茄,探索RNAi技术在番茄抗TYLCV中的防御效果。结果表明,通过RNAi技术干扰TYLCVV1和C1基因可以延缓病毒症状的发生,提高番茄植株对TYLCV的抗性。田间试验结果发现,以TYLCV V1和C1为靶标的RNAi株系RNAi-CP-2和RNAi-Rep-12,不仅可以干扰病毒V1、C1的表达,而且可以干扰TYLCV其他4个基因V2、C2、C3和C4,表明RNAi技术可以在靶标基因附近传递,影响相邻其他基因的表达。本研究结果为番茄抗病毒研究奠定了理论基础。     

表达GFP和gpt基因的重组CVI988病毒的构建

以马立克氏病病毒（MDV）CVI988株基因组为模板,利用PCR技术扩增出约2.7和3.0 kb的基因片段,将上述片段同时插入pUC19中,获得约5.5 kb MDV同源重组臂;以该基因片段的US2区的BglⅡ为插入位点,分别插入基因表达盒CMV-gpt-ployA和CMV-gfp-polyA,构建转移载体pUS-gpt-GFP,将该载体瞬时转染CHO细胞,在荧光显微镜下,可以观察到绿色荧光蛋白的表达;将该转移载体转染已用MDV CVI998株感染的次代CEF细胞,利用MX-HAT培养基筛选重组病毒,并用荧光显微镜挑选表达绿色荧光蛋白的蚀斑,结果获得重组病毒rMDVgptGFP。通过PCR检测和病毒生长测定,证明重组病毒获得纯化。     

RNA沉默介导的转基因烟草抗中国番茄黄化曲叶病毒研究

近年来,中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)病在我国自南向北不断蔓延,发病地块减产甚至绝产,造成了巨大的经济损失.本研究应用RNA沉默(RNA silencing)防治病毒病原理构建TYLCCNV外壳蛋白(coat protein,CP)部分基因片段dsRNA(double-strand RNA)导入本氏烟(Nicotiana benthamiana)获得了抗TYLCCNV的转基因烟草.实验结果表明,目的基因已整合到转基因烟草植株的基因组中.用TYLCCNV侵染性克隆接种转基因烟草,症状观察和PCR检测发现,对TYLCCNV表现为免疫的转基因烟草占14.6％.Northern blot分析表明,在不同的抗病类型转基因植株中,目的基因mRNA的积累量存在明显的差异,其积累量与抗病型呈负相关.研究结果对利用RNA沉默防治TYLCCNV有一定的理论指导意义.     

水稻钙依赖型蛋白激酶0sCPK9基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

水稻钙依赖型蛋白激酶（CDPKs）是一个响应逆境胁迫并在植物发育过程中起重要作用的蛋白激酶。我们采用RT—PCR从水稻品种日本晴（Oryza sativa L．CV．Nipponbare）中克隆了OsCPK9基因靠近翻译起始位点下游的一段280bp的特异基因片段。将该片段以正、反向分别连接到来源于小麦TAK14基因的548bp内含子片段（NCBIaccessionnumber：AF325198）两侧,从而获得pSK．OsCPK9-RNAi的中间表达载体。进而将其克隆到植物双元表达载体pCAMBIA1301中,构建shRNAi表达载体pCAMBIA．05CPK9一RNAi。经酶切和测序鉴定正确后,利用农杆菌介导转化水稻。通过抗性筛选和标记基因hyg和gus进行PCR鉴定,筛选到20株转基因水稻植株,实时荧光定量PCR分析显示,部分转基因植株OsCPK9的表达受到显著抑制。     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

本文重组和构建了新城疫病毒 ( NDV)融合蛋白基因 ,并对该基因进行了鉴定 :将新城疫病毒 F基因片段经 RT— PCR扩增 ,插入经 Eco R I/ Sal 酶切的克隆载体 p UC18及表达载体 p GEMEX,转化大肠杆菌 JM10 9株。用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆 ,再用双酶切法、核酸探针、 PCR及核苷酸序列分析法鉴定 ,表明插入成功并且阅读框架正确     

芸薹属查尔酮异构酶基因家族RNA干扰载体的构建

作为类黄酮途径的第二步关键酶,查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)催化四羟基查尔酮成为柚皮素,用于合成各种类黄酮物质,影响多种性状。芸薹属含有多种重要的油料、蔬菜和观赏植物。本研究从甘蓝型油菜克隆了芸薹属CHI基因家族的干扰片段BCHII(761bp),采用NcoⅠ+AatⅡ和BamHⅠ+XbaⅠ双酶切方案分别将其反义片段和正义片段亚克隆到植物RNA干扰(RNAi)平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成了11674bp的RNAi载体pFGC5941M-BCHII(简称pBCHII),多种PCR检测表明2个片段的插入方向正确,重组载体完整,将其转化根癌农杆菌菌株LBA4404以后获得了工程菌株LBA4404-pBCHII-①。本研究结果将促进研究CHI与芸薹属异花授粉、植株色彩、黄籽和抗逆性等性状的关系和开展相关分子育种。     

马铃薯StTOM1和StTOM3双干扰植物双元表达载体的构建及转化验证

病毒病是制约马铃薯生产的重要因素之一。在拟南芥等植物的研究中发现,抑制寄主因子可以显著降低细胞中病毒的累积量,从而缓解病害症状。本研究在获得与拟南芥寄主因子AtTOM1和AtTOM3具有同源性的马铃薯基因StTOM1和StTOM3的基础上,尝试用RNAi方法同时沉默StTOM1和StTOM3。以pUCCRNAi为中间载体,构建同时含StTOM1和StTOM3双基因干扰片段StT1-StT3的质粒pUCStT1-StT3-dRi（±）,再将双基因干扰片段StT1-StT3切下并连接到双元载体pBI121上。用农杆菌介导方法,将StT1-StT3片段导入马铃薯中,获得转基因马铃薯小苗,阳性率达到83.6%。RT-PCR检测表明,转StT1-StT3马铃薯中StTOM1基因mRNA的表达水平下调了78%,StTOM3基因下调了81%。StTOM1和StTOM3沉默转基因马铃薯的获得,为将来验证和评价StTOM1和StTOM3是否为马铃薯病毒的寄主因子及在创建抗病毒马铃薯新种质的潜力,奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病毒Ts、OH毒株、鱼传染性胰脏坏死病毒DRT毒株的同源性分析

用幼鸡成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)Ts毒株,病毒颗粒经提纯后提取基因组dsRNA.根据已报道的加拿大OH株序列设计引物,用RT-PCR进行 cDNA扩增,获得976 bp、774 bp和997 bp的三个部分重叠的片段,分别克隆于pGEM-Teasy载体,利用SP6,T7特异引物及PCR引物进行序列分析,并连接为一个完整的大片段.结果表明,所克隆片段为2 665 bp的IBDV VP1基因的大开放读框.序列分析表明:Ts株与OH株的核苷酸序列同源性为91 %;与DRT毒株的氨基酸序列同源性为42.5 %.尽管Ts株与DRT株的整体同源性很低,但在VP1蛋白的中部仍发现有高同源区段.在两种病毒中均发现与GTP结合蛋白、依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)相关的保守序列.然而,与单链RNA病毒不同的是:作为RdRp家族特征的G-D-D序列在两种病毒中都未发现.     

水稻简易RNAi载体构建及沉默效果鉴定

RNA干扰(RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法,为了快捷高效地构建水稻(简易RNAi表达载体,本研究采用简易RNAi构建法,设计3'末端9个碱基互补的正向和反向寡聚核苷酸引物,通过聚合酶延伸成为具有反向重复序列的小干扰片段。以pCAMBIA1301-Gt13a为表达载体,将小干扰片段与表达载体经过一次双酶切与连接得到RNAi载体。用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法得到水稻(Oryza sativa ssp.japonica)转基因株系后,用叶片GUS染色和qRT-PCR法,对RNAi转基因水稻和野生型日本晴叶片GUS组织活性和籽粒中目的基因表达量进行检测。水稻叶片GUS染色结果显示,有10株转基因水稻叶片切口处呈现蓝色,而野生型无显色反应,说明RNAi载体T-DNA区域的基因已整合到水稻基因组上,并表达。在mRNA水平上转基因水稻籽粒中目的基因相对表达量降低至18%~55%,差异极显著(P0.01),表明整合在水稻基因组上的小干扰片段能降低目的基因的表达水平。籽粒灌浆成熟后对10株转基因水稻及野生型日本晴籽粒的单粒重、粒长、粒宽和厚度分别进行测量。与野生型日本晴相比,转基因水稻籽粒单粒重发生显著性降低(P0.05),籽粒变小,长和宽都发生显著性变化(P0.05),说明简易RNAi载体对水稻目的基因的表达起到很好的沉默效果。本研究不仅为利用简易RNAi构建法研究水稻功能提供了依据,也为快捷高效地研究水稻基因功能提供了基础资料。     

表达禽流感病毒核蛋白重组噬菌体的构建

摘要：利用PCR技术，扩增去除部分序列、长度为1320 bp、编码440个氨基酸的禽流感病毒(AIV)NP基因片段，将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR-NP，以此重组载体转化大肠杆菌E2，用溶菌酶缺陷噬菌体T4-Z1感染重组E2菌，重组载体与缺陷噬菌体T4-Z1基因发生同源重组，将NP基因整合到噬菌体基因组中，用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-Z1-NP。经Western blot检测证实，T4-Z1-NP表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。成功构建了表达禽流感病毒核蛋白的重组噬菌体。     

应用重组PCR技术构建植物基因RNA干扰的结构

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来生物学领域研究的热点之一,本研究应用改进的重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因及玉米淀粉分支酶基因的RNA干扰构件,以探索一条简便快捷,适应范围广范的植物基因RNAi结构构建方法.