水稻简易RNAi载体构建及沉默效果鉴定

RNA干扰(RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法,为了快捷高效地构建水稻(简易RNAi表达载体,本研究采用简易RNAi构建法,设计3'末端9个碱基互补的正向和反向寡聚核苷酸引物,通过聚合酶延伸成为具有反向重复序列的小干扰片段。以pCAMBIA1301-Gt13a为表达载体,将小干扰片段与表达载体经过一次双酶切与连接得到RNAi载体。用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法得到水稻(Oryza sativa ssp.japonica)转基因株系后,用叶片GUS染色和qRT-PCR法,对RNAi转基因水稻和野生型日本晴叶片GUS组织活性和籽粒中目的基因表达量进行检测。水稻叶片GUS染色结果显示,有10株转基因水稻叶片切口处呈现蓝色,而野生型无显色反应,说明RNAi载体T-DNA区域的基因已整合到水稻基因组上,并表达。在mRNA水平上转基因水稻籽粒中目的基因相对表达量降低至18%~55%,差异极显著(P0.01),表明整合在水稻基因组上的小干扰片段能降低目的基因的表达水平。籽粒灌浆成熟后对10株转基因水稻及野生型日本晴籽粒的单粒重、粒长、粒宽和厚度分别进行测量。与野生型日本晴相比,转基因水稻籽粒单粒重发生显著性降低(P0.05),籽粒变小,长和宽都发生显著性变化(P0.05),说明简易RNAi载体对水稻目的基因的表达起到很好的沉默效果。本研究不仅为利用简易RNAi构建法研究水稻功能提供了依据,也为快捷高效地研究水稻基因功能提供了基础资料。