家畜类腔前卵泡的体外分离方法和培养体系研究进展

摘要： 在哺乳动物体内，启动卵泡生长的机制还不完全清楚，卵泡的体外培养遇到较大困难；由于不同物种卵泡的成熟时间和调节机理有较大差异，因此它们的体外培养技术还不能通用。在过去的几年，不同动物的卵泡体外培养体系的建立均有一定程度的发展，而且对卵泡的发育过程也有了很好地了解，但是获得高质量的成熟卵母细胞还有相当的距离。在目前的技术条件下，啮齿类的腔前卵泡已能经体外培养发育至有腔卵泡期，而且从有腔卵泡分离的卵母细胞经体外成熟、体外受精后已能产生新的个体。但家畜类腔前卵泡的体外培养体系还处于早期研究阶段，探讨早期卵泡的发育特征，建立成功的体外分离方法和培养体系是开发家畜类卵巢资源的基础。     

6－二甲氨基嘌呤对牛卵母细胞孤雌发育的影响

本研究系统探讨了 6-二甲氨基嘌呤 ( DMAP)对牛卵母细胞孤雌发育的影响。牛卵母细胞体外成熟 2 4 ,2 6,2 8或 30 h后 ,先用含 7%乙醇的培养液激活处理 5min,然后在含 2 mmol/L DMAP的培养液中培养 3h,或直接在培养液中进行培养。结果发现 ,经 2 mmol/L DMAP培养处理 3h的卵母细胞的激活分裂率和囊胚发育率均明显高于未处理的卵母细胞 ,特别是对于体外成熟 2 4 h和 2 6h的卵母细胞差异更为显著。如若在 DMAP处理的基础上同时加入 5μg/m L的细胞松驰素 ( CB) ,卵母细胞激活后的囊胚发育率则得到进一步提高 ( 48.7%比 37.5% )。研究结果表明 ,DMAP和 CB对卵母细胞激活后的孤雌发育有促进作用 ,并能降低卵龄所引起的激活效果差异     

发情牛血清在猪卵母细胞成熟中的应用

为了检验发情牛(Bos taurus)血清在猪卵母细胞成熟中的应用,实验分别在成熟培养液中加入不同的血清,观察卵母细胞的成熟效果,并通过孤雌激活胚胎和重构胚的体外发育能力来判断血清对卵母细胞质量的影响:研究还进行了用发情牛血清成熟的卵母细胞构建的核移植胚胎的体内发育试验.结果表明,发情牛血清,成年牛血清和胎牛血清在猪卵母细胞的成熟率方面没有显著差异(P>0.05);卵母细胞成熟时加入不同的血清,对卵母细胞体外发育能力的影响不显著(P>0.05);来自含发情牛血清成熟液培养的卵母细胞,与胎儿成纤维细胞构建的克隆胚胎能够完成全期发育.     

牛去核卵母细胞能够被孤雌激活并发育到桑椹胚

为了探讨实验牛去核卵母细胞能否被激活,及其激活后的发育能力,本研究利用化学激活法对牛去核卵母细胞进行孤雌激活,然后在体外颗粒细胞饲养层上进行培养,同时在不同的时间采用免疫荧光技术对α-微管蛋白(α-tubulin)进行染色,以观察去核卵母细胞与正常卵母细胞中微管分布动态变化的差别.结果表明去核卵母细胞经激活后在体外培养能够发育到桑椹胚,去核卵母细胞内α-tubulin的分布在分裂初期没有分区现象,对照组未去核卵母细胞内的α-tubulin抗体出现了分区现象.     

不同发情周期阶段和不同体积卵泡的卵母细胞对体外受精及其发育的影响

根据母牛卵巢黄体发育状态将实验用卵巢相应地划分为早期黄体(ELP)、功能黄体(LP)和退化黄体(LLP)三个试验组(实验1);实验2则按实验卵巢上卵泡的表面直径大小划分为小于2mm,2～6mm 和大于6mm 三组.采用注射器抽取法采集卵泡里的卵母细胞,然后按 Lu 等报导的方法进行体外成熟培养和体外受精。受精卵继续在体外条件下培养到囊胚阶段。实验2还进一步观察了囊胚体外发育到孵化囊胚的比率。结果表明,来自不同发情周期阶段的牛卵母细胞,经体外成熟培养后,各组体外受精分裂率(74.3%～78.4%)及体外囊胚发育率(27.7%～31.3%)均无显著差异;而来自表面直径小于2mm 卵泡的卵母细胞,其体外受精分裂率和体外囊胚发育率均显著地低于2～6mm 及大于6mm 组(P<0.01);来自直径大于6mm 卵泡的卵母细胞受精后的早期胚胎体外囊胚发育率均显著高于其余两组(p<0.01)。表明卵泡及其卵母细胞在体内的发育程度对其后体外受精及早期胚胎进一步发育的能力只有一定的影响。     

玻璃化冷冻对猪体外成熟卵母细胞染色体与纺锤体的影响

通过冷冻体外培养成熟的猪MⅡ卵母细胞,分析了不同冷冻方案对卵母细胞形态、纺锤体微管和染色体形态结构影响,探讨冷冻前后猪卵母细胞超微结构的变化,以及玻璃化冷冻对卵母细胞后续发育能力的影响。     

卵母细胞生发泡破裂(GVBD)发生前后脱卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响

成熟卵母细胞的细胞质对供体细胞的重编程有作用,卵母细胞的成熟状态成为核移植过程的关键因素。为了研究卵母细胞体外成熟过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)发生前后脱卵丘细胞对卵母细胞的影响,本研究采用猪(Sus scrofa)卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外培养,每隔5 h取卵母细胞采样,置于地衣红染液中染色,根据卵母细胞染色体构型的变化确定卵母细胞的分期,然后在21、27和42 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,观察极体数。体外培养不同时间压片观察结果表明,直径2~6 mm卵泡卵母细胞在体外培养时,2~17 h大部分卵母细胞处于GV期(88.30%~52.38%);22 h有63.25%的卵母细胞处于生发泡破裂至前中期(germinal vesical breakdown~premetaphaseⅠ,GVBD~pre-MⅠ);27 h处于中期Ⅰ(metaphaseⅠ,MⅠ)的卵母细胞最多(42.25%);32 h处于后期Ⅰ(anaphaseⅠ,AⅠ)的卵母细胞比例最多(29.90%);37 h处于末期Ⅰ(telophaseⅠ,TⅠ)的卵母细胞比例最多(40%);42 h绝大部分卵母细胞达到了中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)(72.81%)。分别采取21、27和44 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,发现21 h脱卵丘细胞后卵母细胞成熟率为25.56%,低于27 h处理卵的成熟率(34.33%),42 h脱卵丘细胞的卵母细胞的成熟率最高达到84.33%。结果说明,体外卵母细胞成熟过程中,卵丘细胞对卵母细胞的成熟具有重要意义,为进一步探讨和分析猪卵母细胞体外成熟培养的方法,改良体外培养体系,提高猪卵母细胞体外培养成熟率,进而提高胚胎体外培养质量提高奠定基础。     

乙二胺四乙酸钠对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响

本研究探讨了乙二胺四乙酸钠(EDTA-N a)对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在不添加或添加不同浓度EDTA-N a的成熟培养液中体外成熟44~48 h,挑选核成熟卵母细胞进行孤雌激活,然后移到不添加或添加不同浓度EDTA-N a的胚胎培养液中进行体外培养168 h。结果说明:(1)成熟液中添加适当浓度(25~100μm o l/L)EDTA-N a对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用,在EDTA-N a浓度为100μm o l/L时,效果最佳;(2)胚胎培养液中添加适当浓度(25~100μm o l/L)EDTA-N a,对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用,在EDTA-N a浓度为100μm o l/L时,效果最佳;(3)成熟液和胚胎培养液中同时添加100μm o l/L EDTA-N a对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用;(4)成熟液或/和胚胎培养液中添加不同浓度EDTA-N a,对体外成熟培养后的猪核成熟卵母细胞及孤雌激活后的4-细胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱都无显著影响。     

无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟方法的研究

卵母细胞生长发育和成熟调控机理的研究,是生殖生物学领域研究的热点和难点。研究发现,卵丘细胞的存在与否严重影响卵母细胞的体外成熟质量,且小鼠无卵丘的卵母细胞经体外成熟并常规体外受精后未能得到“试管后代”,表明常规体外培养方法明显降低无卵丘的卵母细胞发育潜能。可能的原因是:(1)卵母细胞与颗粒细胞间的间隙连接丢失,这种连接对卵母细胞的胞质成熟是至关重要的。(2)皮层颗粒的减少或继续生成路径的障碍。(3)卵母细胞易于贴底,造成变形,从而可能引起卵母细胞内细胞器机械性移位,造成损伤,且贴底后可能影响卵母细胞与培养基的物质交换。因此,探明卵丘细胞在卵母细胞体外成熟的作用及机制,探索培养无卵丘的水牛卵母细胞的新方法,对于今后进一步提高卵母细胞成熟质量具有重大的指导意义。本研究针对去卵丘细胞的卵母细胞体外培养存在的问题,以卵巢组织、卵丘细胞为介质来模拟卵母细胞在体内的状态,试验分为5组:M1,直接培养法(对照组);M2,与单层卵丘细胞共培养法;M3,未扩展卵丘细胞包围法;M4,扩展卵丘细胞团支撑法;M5,卵巢组织薄片包围法。培养24 h后计算第一极体(PB1)排出率,随后对这些卵母细胞进行孤雌激活。结果发现:成熟24 h时,M4组的第一极体排出率明显高于M1组和M5组,其他各组间没有显著差异(P>0.05);孤雌激活结果显示M5组的卵裂率显著低于M1组(P<0.05),而M2组与M1组间没有差异(P>0.05);但M3和M4两组的囊胚发育率显著高于M1组和M5组(P<0.05)。结论:(1)扩展卵丘细胞团支撑法支持无卵丘的水牛卵母细胞的体外核质成熟,而未扩展卵丘细胞包围法促进卵母细胞胞质的成熟,这可能是通过重新构建卵丘-卵母细胞间的间隙连接实现的;(2)与单层卵丘细胞共培养法并不能促进无卵丘的水牛卵母细胞的核成熟及其发育潜力;(3)用卵巢组织包围不能模拟体内卵巢的环境,且卵巢组织可能分泌抑制卵母细胞胞质成熟的因子。目前对无卵丘卵母细胞的培养方法的研究甚少,而我们建立的卵丘细胞团包围/支撑法及卵巢组织包围培养法未见类似的报道。本研究初步建立了水牛无卵丘卵母细胞的有效培养方法,将为研究卵母细胞生长发育和成熟调控机理提供新的模型,为利用无卵丘的水牛卵母细胞提供理论和技术支持。     

牛生发泡期裸卵体外成熟培养体系的建立

本研究通过牛(Bos taurus)卵母细胞体外成熟培养不同时间(0和10 h),剥除卵母细胞外周的颗粒细胞后继续培养,观察其与不脱颗粒细胞正常体外成熟培养卵母细胞之间的差异.研究结果显示:成熟培养0脱颗粒细胞的卵母细胞,与正常成熟培养的卵母细胞在成熟率(19.51%vs.80.14%,P<0.05)、卵裂率(27.08%vs.82.61%,P<0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(7.69%vs.21.71%,P<0.05)差异显著;成熟培养10 h后脱颗粒细胞的牛卵母细胞,与正常体外成熟培养的卵母细胞相比,在成熟率(82.71%vs.80.14%,P>0.05)、卵裂率(83.01%vs.82.61%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(19.30%vs.21.71%,P>0.05)无显著差异.向成熟培养10h脱颗粒细胞的卵母细胞内注射pVenus-Hlfoo mRNA,pVenus,pDsRed1-N1和重组质粒pDsRedl-Hle都能够得到表达.非功能标记基因显微注射组与对照组在卵母细胞成熟率(81.42%vs.82.03%,P>0.05)、卵裂率(75.24%vs.78.15%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(17.42%vs.18.82%,P>0.05)上差异不显著.研究结果提示:在成熟培养10 h,剥离颗粒细胞不会影响牛卵母细胞的发育潜能,这一技术平台可以用于牛卵母细胞体外成熟分子机制的研究.     

Assessment of the effect of the climatic parameters on the distribution of the Al-Fe-humus horizons in the soils of the Russian planes

A comparative-ecological approach for studying the general regularities of soil ecology on the basis of geoinformation systems is suggested. It has been applied to analyze the distribution of Al-Fe-humus horizons. The quantitative climatic parameters of soils with Al-Fe-humus horizons have been estimated, and the relationships between them have been established. The applicability of this approach for assessing the general regularities of soil ecology is shown.     

优化书库环境加强图书保护

通过分析损害图书的各种自然因素,阐明优化书库环境、加强图书保护的重要性。     

Measuring the costs of improving the quality of the environment in the United States

The analysis in this paper is directed at comparing the relative effectiveness of meeting the objectives outlined in the recently passed Clean Air Act Amendments of 1990 through taxation and through regulation. The analytical vehicle used in the analysis consists of a computable general equilibrium model composed of 12 producing sectors, 13 consuming sectors, 6 household categories classified by income, a foreign sector and a government. We find first that, irrespective of what type of strategy is followed, both output and consumption decline. Hence, there is an identifiable and quantifiable tradeoff between economic activity (economic growth) and the quality of the environment. Beyond this, the aggregate loss in production and economic welfare (measured by consumption expenditures and utility) is less under a policy which stresses reliance on alternative fuels than through one that requires the installation of pollution abatement devices.     

加强舆论宣传营造良好氛围为全面建设小康社会做贡献--在全省水土保持广播大赛开播仪式上的讲话

今天,省水土保持委员会办公室、福建人民广播电台联合举行全省水土保持广播大赛开播仪式.这是我省纪念<水土保持法>颁布实施12周年和江泽民同志关于<治理水土流失、改善生态环境、建设秀美山川>重要批示发表6周年,为福建"生态省"建设营造良好社会氛围的一次具体行动.     

定位拟南芥中生物钟核心调控元件

生物钟在动物植物生理调节中都发挥着重要的作用,但是目前对于其调节机制的了解仍然十分有限。在植物中存在白昼和夜晚的振荡器,这些振荡器包含了拟南芥中已经发现的一些相关的生物钟基因。目前的模型认为白昼振荡器相关基因     

类芦的生长与VA菌根的关系分析

类芦是我国南方快速绿化水蚀荒漠化地区的优良草种。对类芦根蔸土壤中VA菌根真菌的调查表明，栽植类芦后，土壤中的VA菌根真菌数量大幅度增加，并与类芦根系形成一种协调的共生体系，极显著地促进了类芦的生长。新栽植类芦时，可在基肥中增施少量VA菌根土与磷肥，以促进土壤中VA菌根菌的快速繁衍。     

跟踪学科前沿，引导学科发展——《农业工程学报》的发展探索

论述了《农业工程学报》跟踪农业工程学科发展的成功经验，详细分析了未来《农业工程学报》跟踪学科各个专业的报道方向。指出随着学科的发展及时调整学术期刊的报道方向是科技学术期刊的任务和职责，是使期刊保证及时反映相关学科的发展，保持在学科发展中应有的促进作用，在众多期刊的竞争中立于不败之地的保证。在充分分析中国学术期刊面临的形势和问题、机遇与挑战的基础上，提出了学术期刊如何规避不利因素等应对策略，为中国科技学术期刊的发展提供参考。     

阳澄湖东湖蓝藻密度与前期环境因子的关系

根据阳澄湖2010-2011年水环境和气象观测数据,应用相关分析和逐步回归等方法,对阳澄湖东湖前期环境因子与蓝藻密度间的关系进行分析.结果表明,(1)影响阳澄湖蓝藻密度的重要环境因子有水温、溶解氧、营养盐和气温、降水、风向、风速等.(2)气温是制约阳澄湖蓝藻暴发的主要因子,日照条件不是导致蓝藻暴发的关键因子,微风、少降水的气象条件有利于蓝藻上浮、聚集并形成水华,湖面蓝藻的南北飘移与盛行风向基本一致.(3)在水体满足富营养化的条件下,当某日前5d平均气温＜30℃、日平均日照时数为4～10h、日平均降水量＜3.0mm、平均风速为1～2.5m/s、盛行风向持续2d以上,则易暴发蓝藻水华.(4)利用前期对蓝藻密度变化有影响的重要环境因子建立了蓝藻密度预报方程,并对阳澄湖蓝藻水华发生状况进行拟合和试报,结果表明所建预报方程拟合率较高,但峰值误差较大.研究结果可为阳澄湖蓝藻监测预警和生态环境保护提供参考.     

下一代Internet发展综述——下一代Internet的产生和发展

本文论述了IPV6产生的社会原因,阐述了国外发达国家下一代Internet的发展状况和中国下一代Internet的发展状况及最新进展。