转基因鸡制备方法的研究进展

在获得转基因哺乳动物的基础上，由于禽类(鸡)作为生物反应器本身所具有的优势．许多研究者投向制备转基因鸡的研究上。本文简要叙述了常用的制备转基因鸡的方法。其中，结合本实验室的情况，重点介绍了胚盘直接注射法。     

逆转录病毒载体介导的转基因鸡研究进展

转基因鸡作为重要的经济动物和理想的生物反应器,具有广阔的应用前景。鸡基因组测序的完成加快了转基因鸡的研究和发展。病毒载体法是转基因鸡制备的主导方法之一,具有效率高和遗传稳定性良好的优势。本文对逆转录病毒载体特征、复制缺陷型病毒载体和复制整合双缺陷型病毒载体的优缺点及其介导的转基因鸡研究进行综述,展望人工核酸酶技术结合复制整合双缺陷型逆转录病毒载体在转基因鸡研究领域的应用前景。     

鸡输卵管生物反应器的研究进展

随着人们对营养类蛋白、医用类蛋白需求量的增长,建立经济高效的生产技术平台成为转基因动物研究的重要领域,鸡输卵管生物反应器作为转基因鸡重要的应用器官得到越来越多的重视。目前,构建用于携带外源基因的高效表达载体和良好的导入方法是制备能够稳定生产外源基因转基因鸡的关键技术,文章对鸡输卵管生物反应器的研究进展进行了综述,并提出了存在的问题。     

精子介导法制备转基因鸡的研究

以LacZ基因为报告基因，构建载体质粒p-OV-β-Gal，转移到鸡早期胚胎内，对外源基因的整合及表达情况进行检测分析，为制备转基因鸡探索新的方法。采用脂质体介导法、精子介导法以及电激法相结合的方法将载体质粒p-OV-β-Gal转移到鸡早期胚胎内，进行转基因鸡研究，结果发现其外源基因整合阳性率为13.2%（7/53），表达阳性率为20.7%（11/53）。说明该方法可作为制备转基因鸡的有效方法。     

转基因鸡制备方法的研究进展

利用转基因技术进行鸡的抗病育种．提高其生产性能，生产医用蛋白等是当代生物技术领域研究的焦点之一。本文简要叙述了反转录病毒法、原始生殖细胞转染法（PGCs）、精子介导法、胚胎显微注射法等几种制备转基因鸡的方法。     

鸡胚盘细胞的研究进展

鸡胚盘细胞存在于未孵化的新鲜种蛋中，是一种具有多潜能性的胚胎干细胞。通过胚盘细胞移植法可制备体细胞或种系细胞嵌合体。如果将外源基因转入受体胚盘，受体胚后代则可能成为转基因鸡。利用胚盘细胞作为转基因载体，生产转基因鸡是研究禽类转基因的一种理想方法。作者就胚盘细胞及其研究进展给予综述。     

CRISPR/Cas9 knock-in介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究进展

利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的生物技术。鸡输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免蛋白提取过程中对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。目前利用慢病毒结合原始生殖细胞(PGCs)制备转基因鸡被认为是最可行的方法,但因外源基因随机整合且生殖系传递效率较低,使转基因鸡研究受到技术上的限制。而2013年问世的CRISPR/Cas9基因敲入(CRISPR/Cas9 knock-in)技术能够使外源基因精准定向插入基因组特异性位点,这对生产输卵管特异性转基因鸡具有重大意义。文章综述了鸡输卵管反应器的研究进展、CRISPR/Cas9 knock-in技术在输卵管特异性表达转基因鸡研究和鸡育种领域的应用现状,并指出了目前存在的问题和相应的解决办法。     

转基因鸡的研究现状及其应用展望

与哺乳动物的转基因相比，禽类的转基因研究遇到了更大阻力，尽管如此，一些很有希望的生产转基因鸡的方法还是在人们的不断努力下产生了．不少人用基因做注射的方法得到了转基因鸡．转基因鸡的潜在利用价值极大，本综述对目前鸡的转基因研究进行总结并探讨了转基因技术在家禽抗菌育种中的应用及转基因鸡的某些特殊利用价值．     

生殖细胞在转基因鸡研究中的应用

转基因研究已证明鸡是一个很好的试验材料.转基因鸡的研究,极有助于动物生物工程、生物反应器工程和实验模型的发展.虽然它的几个生理特性对有效地进行转基因带来了一定的障碍,但是转基因鸡遗传和生理特性上的各种优势是无可比拟的.目前已从胚胎中获取原始生殖细胞(PGCs)或从成熟公鸡中得到睾丸细胞,建立了胚胎介导转基因系统和睾丸介导转基因系统,这些方法比较有效且有微小的技术改进.本文回顾了以前用原始生殖细胞和睾丸细胞进行转基因鸡的研究,并总结了鸡模型在生物医学和生物工程学上的发展以及在这个领域的成果.     

转基因显微注射剂量对鸡胚转基因效率和胚胎发育的影响

研究旨在探讨显微注射剂量对鸡胚孵化和转基因效率的影响。将SB转座子介导的转基因载体分别设置为20 ng、50 ng和100 ng,通过显微注射技术注射至14HH鸡胚血管,继续孵化至出雏。检测孵化第7、14和21天的鸡胚成活率,出雏率、初生体重和性腺阳性率。结果表明,50 ng剂量组鸡胚性腺阳性率明显高于其它两组,且各剂量组间绿色荧光蛋白基因表达强度差异不显著。各剂量组之间种蛋成活率、出雏率和雏鸡初生重差异均不显著(P0.05)。本研究为鸡胚显微注射剂量优化提供参考,对提高转基因鸡制备效率具有重要意义。     

鸡鸭异种间转基因嵌合体的制备

为研究异种间嵌合体的制作方法及供体和受体的嵌合情况,同时探讨绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值。本研究利用脂质体介导法将外源pEGFP-N3质粒转入到北京鸭原始生殖细胞(PGCs)中,将转染后的PGCs以微注射法转移至受体北京油鸡的胚下腔,探索转基因鸡鸭嵌合体的制作方法。结果显示:PGCs在转染后6 h开始有外源基因的表达,体外培养24 h后获得了33.6%的转染效率。120枚蛋在整个孵化期中共有33枚鸡胚发育,但最终无孵化成活鸡。在13个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为10.8%。PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,8只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞。研究结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因禽类是可行的。鸭PGCs能够迁移并定居到鸡胚性腺中,并有可能在鸡性腺中增殖分化成有功能的配子。     

Germ cells and transgenesis in chickens

Chickens have proven to be useful organisms for transgenic research. This work provides enormous benefits in advancing animal biotechnology and aids in the development of unique technologies for bioreactor production and experimental model development. The various advantages of chicken transgenesis are derived from the genetic and physiological characteristics of this organism, although several physiological properties have impeded the development of an efficient transgenic system. We have developed embryo-mediated and testis-mediated transgenic systems using chicken primordial germ cells (PGCs) from embryos and testicular cells from adult males. These methods are efficient and involve minimal technical effort. Here, we review previous transgenic research using PGCs and testicular cells from chickens. Furthermore, we have summarized the development of the chicken model system in biomedical science and biotechnology and our recent achievements in this field.     

Fat-1基因载体构建及其在家鸡中的体外表达

试验旨在构建一种适合于家禽体外表达的ω-3脂肪酸脱氢酶Fat-1基因的真核生物表达载体,为后续转基因鸡的生产奠定基础。根据家鸡密码子使用频率,对秀丽隐杆线虫Fat-1基因进行优化改造;将改造后的Fat-1基因(cFat-1)连接至pLL3.7表达载体,构建重组质粒pLL3.7-cFat-1;经PCR、酶切、序列分析等手段对重组质粒进行鉴定;用胰酶消化法培养鸡成纤维细胞,利用TurboFect^TM转染试剂将pLL3.7-cFat-1转染体外培养的成纤维细胞;通过RT-PCR检测和绿色荧光观察分析cFat-1基因在细胞中的表达。结果表明cFat-1基因在鸡成纤维细胞中高效转录并表达,成功构建了可在家禽体外表达cFat-1基因的特异性表达载体。本研究首次获得可在家禽体外表达cFat-1基因的转基因细胞系,证实了经基因改造后cFat-1基因可在家禽体外的高效转录和表达,为后续制备富含ω-3脂肪酸的转基因鸡奠定基础。     

Primordial germ cells (PGCs) as a tool for creating transgenic chickens

The transgenic chicken has great potential as a bioreactor for the production of valuable pharmaceutical proteins, notably in the oviduct/egg. Whereas conventional transgenic approaches have significant limitations in this species, an alternative approach employing primordial germ cells (PGCs), the progenitor cells to ova and spermatozoa, has now been successfully applied to the insertion of exogenous genes into birds. Recent developments in manipulating avian embryos make it possible to produce germline chimeras derived from transferred PGCs. In this review we describe the migration pathway of chicken PGCs during early development. We then summarize different methods for the isolation of PGCs and the diversity of techniques used to introduce genes into these cells. Finally, we describe an in vitro assay for testing tissue-specific vectors designed to express heterologous proteins in transgenic chickens.     

鸡输卵管生物反应器的研究进展

目前鸡输卵管生物反应器的研究集中在以卵清蛋白调控区来调控外源基因的表达。鸡输卵管生物反应器的研究以输卵管细胞的培养为起点 ,再研究外源基因在输卵管内定位表达的可能性 ,最后制作转外源基因能稳定遗传的转基因鸡。本文对鸡输卵管生物反应器研究作一综述 ,提出了存在的问题并作以展望。     

改良背主动脉注射法对鸡胚发育与转基因表达效率的影响

背主动脉注射是生产转基因鸡的经典方法,该方法不需换壳培养,但壳内注射技术难度大,并且无法实时观察后期胚胎发育情况。本实验对背主动脉注射法进行了改进,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)壳外注射至150枚HH 14~16期(Hamburger-Hamilton Stage 14~16)鸡胚背主动脉中,再进行换壳培养,继续孵化至出壳,观察和分析改良背主动脉注射法与传统背主动脉注射法和胚盘下腔注射法对发育8、14、18、21 d鸡胚存活率、孵化率以及EGFP阳性检出率的影响。结果表明:改良背主动脉注射组鸡胚存活率均高于传统背主动脉注射组与胚盘下腔注射组(P<0.05或P<0.01);改良背主动脉注射组的鸡胚孵化率(37%)高于传统背主动脉注射组(16%)与胚盘下腔注射组(28%)(P<0.01);荧光蛋白手电筒检测显示,改良背主动脉注射组鸡胚EGFP阳性率(17%)明显高于传统背主动脉注射组(13%)与胚盘下腔注射组(12%)(P<0.01)。综上,背主动脉壳外注射结合换壳培养提高了转基因鸡胚胎孵化率和EGFP阳性检出率,对提高转基因鸡效率具有重要价值。     

The evolution of chicken stem cell culture methods

1. The avian embryo is an excellent model for studying embryology and the production of pharmaceutical proteins in transgenic chickens. Furthermore, chicken stem cells have the potential for proliferation and differentiation and emerged as an attractive tool for various cell-based technologies.

2. The objective of these studies is the derivation and culture of these stem cells is the production of transgenic birds for recombinant biomaterials and vaccine manufacture, drug and cytotoxicity testing, as well as to gain insight into basic science, including cell tracking.

3. Despite similarities among the established chicken stem cell lines, fundamental differences have been reported between their culture conditions and applications. Recent conventional protocols used for expansion and culture of chicken stem cells mostly depend on feeder cells, serum-containing media and static culture.

4. Utilising chicken stem cells for generation of cell-based transgenic birds and a variety of vaccines requires large-scale cell production. However, scaling up the conventional adherent chicken stem cells is challenging and labour intensive. Development of a suspension cell culture process for chicken embryonic stem cells (cESCs), chicken primordial germ cells (PGCs) and chicken induced pluripotent stem cells (ciPSCs) will be an important advance for increasing the growth kinetics of these cells.

6. This review describes various approaches and suggestions to achieve optimal cell growth for defined chicken stem cells cultures and use in future manufacturing applications.