制作石蜡切片验证鸡胚盘显微注射外源DNA的效果

胚盘下腔是禽类胚胎发育到囊胚时出现的特有腔室,通过向禽类胚盘下腔注射外源细胞或基因是常用的制备嵌合体和转基因禽类的方法。本试验通过制备石蜡切片,验证胚盘下腔显微注射效果的方法。以白来航鸡种蛋为模型,向胚盘下腔中微注射少量的标记物,经过琼脂糖包埋脱水后制作石蜡切片,获得完整的鸡胚Ⅹ期胚盘切片。经过HE染色,可以观察到鸡胚Ⅹ期胚盘的上下胚层及胚盘下腔,鉴定标记物是否准确注入胚盘下腔中。结果表明利用本方法可以获取完整胚盘各个切面,准确检验胚盘显微注射效果,为改进显微注射方法和提高转基因禽类制备效率提供新的有利途径。     

利用"转基因精子"生产大群转基因家禽

目前制作转基因家禽通常有两种方法：第一种是显微注射法,是将外源基因显微注射到新生蛋胚盘内,DNA随机插入基因组,封壳后再孵化。这一方法效率的好坏过多地依赖于操作人员的技术,成功率约为显微注射受精蛋的3％-5％;第二种方法涉及原始生殖细胞的体外转染,转染后的细胞先移入受体胚盘中,然后封壳再孵化。这一方法的优势在于它可通过同源重组产生基因敲除雏鸡。目的基因可通过诸如Cre—Lox系统的适当技术步骤被敲除。最近还发展了一项新技术,如利用慢病毒载体转染鸡胚盘。虽然这些技术取得了成功,     

转基因鸡制备方法的研究进展

在获得转基因哺乳动物的基础上，由于禽类(鸡)作为生物反应器本身所具有的优势．许多研究者投向制备转基因鸡的研究上。本文简要叙述了常用的制备转基因鸡的方法。其中，结合本实验室的情况，重点介绍了胚盘直接注射法。     

鸡Ⅹ期胚盘细胞分散培养与整胚培养比较初探

为比较鸡Ⅹ期胚盘细胞分散培养与整胚培养效果,对鸡Ⅹ期胚盘细胞分别进行分散培养和整胚培养并进行传代,观察细胞生长情况,通过碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定计算阳性克隆率;结果,分散培养的细胞生长状态良好,整胚培养的细胞贴壁能力较差,培养过程中细胞易分化;传代后两种方法培养的细胞AKP阳性克隆率差异显著(P0.01)。表明鸡Ⅹ期胚盘细胞分散培养效果较为理想。     

转基因鸡制备方法的研究进展

在获得转基因哺乳动物的基础上,由于禽类(鸡)作为生物反应器本身所具有的优势,许多研究者投向制备转基因鸡的研究上。本文简要叙述了常用的制备转基因鸡的方法。其中,结合本实验室的情况,重点介绍了胚盘直接注射法。     

鸡胚胎干细胞及其应用研究进展

鸡胚胎干细胞是一种多能性干细胞，从X期胚盘分离胚盘细胞或早期鸡胚的生殖嵴分离原始生殖细胞，经体外长期抑制分化培养可得到鸡胚胎干细胞。为维持细胞在培养过程中的未分化状态，需要采用饲养层细胞培养，同时设计合理的培养液配方并添加多种抑制分化或促进增殖的细胞因子。通过碱性磷酸酶活性检测、胚胎表面特异性抗原检测、分化试验及嵌合体试验等方法，可对鸡胚胎干细胞进行准确鉴定。文章主要就鸡胚胎干细胞的分离、培养与鉴定方法的研究进展及其应用前景进行简要综述，为进一步发展更高效的鸡胚胎干细胞培养体系并应用于生产实践提供一定的借鉴。     

鸡X期胚盘细胞分散培养与整胚培养比较初探

为比较鸡X期胚盘细胞分散培养与整胚培养效果,对鸡X期胚盘细胞分别进行分散培养和整胚培养并进行传代,观察细胞生长情况,通过碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定计算阳性克隆率;结果,分散培养的细胞生长状态良好,整胚培养的细胞贴壁能力较差,培养过程中细胞易分化;传代后两种方法培养的细胞AKP阳性克隆率差异显著(P<0.01).表明鸡X期胚盘细胞分散培养效果较为理想.     

改良背主动脉注射法对鸡胚发育与转基因表达效率的影响

背主动脉注射是生产转基因鸡的经典方法,该方法不需换壳培养,但壳内注射技术难度大,并且无法实时观察后期胚胎发育情况。本实验对背主动脉注射法进行了改进,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)壳外注射至150枚HH 14~16期(Hamburger-Hamilton Stage 14~16)鸡胚背主动脉中,再进行换壳培养,继续孵化至出壳,观察和分析改良背主动脉注射法与传统背主动脉注射法和胚盘下腔注射法对发育8、14、18、21 d鸡胚存活率、孵化率以及EGFP阳性检出率的影响。结果表明:改良背主动脉注射组鸡胚存活率均高于传统背主动脉注射组与胚盘下腔注射组(P<0.05或P<0.01);改良背主动脉注射组的鸡胚孵化率(37%)高于传统背主动脉注射组(16%)与胚盘下腔注射组(28%)(P<0.01);荧光蛋白手电筒检测显示,改良背主动脉注射组鸡胚EGFP阳性率(17%)明显高于传统背主动脉注射组(13%)与胚盘下腔注射组(12%)(P<0.01)。综上,背主动脉壳外注射结合换壳培养提高了转基因鸡胚胎孵化率和EGFP阳性检出率,对提高转基因鸡效率具有重要价值。     

脂质体转染胚盘细胞将外源质粒pEGFP-C2导入鹌鹑胚的研究

运用脂质体转染第Ⅹ期胚盘细胞的方法将外源质粒pEGFP C2经脂质体包裹后注射到鹌鹑种蛋Ⅹ期胚盘下腔,孵化种蛋.提取孵化6d的鹌鹑胚基因组DNA,进行PCR检测,嵌合体阳性率为84％,证实外源基因在胚胎中的表达.对孵化至出壳的G0代鹌鹑组织进行DNA提取并PCR分析,以及组织切片荧光检测,证实外源基因在G0代鹌鹑组织中成功表达.结果表明脂质体转染胚盘细胞是一种制备转基因鹌鹑行之有效的方法.     

鸡原肠胚期细胞收集方法的优化

鸡原肠胚(Gastrula stage cell,GSC)是一个位于胚盘内膜与卵黄之间的一层细胞层,细胞数量约为5万～6万个[1],是可分化细胞,因此是很好的试验研究材料.由于它位于胚盘内膜与卵黄之间,这给该种细胞的收集带来了很大的难度,收集的细胞常常数量少且带有大量卵黄,很难除去,但对此材料的收集却没有有效的参考方法,为后续试验带来了麻烦.本研究通过对鸡原肠胚不同收集方法的研究比较,确定了最佳的鸡原肠胚期细胞的收集方法,为以后与该细胞相关的试验研究奠定方法学的基础.     

脂质体转染胚盘细胞制备携pEGFP-C2基因的转基因鹌鹑

利用脂质体转染第X期胚盘细胞的方法将外源质粒pEGFP-C2经脂质体包裹后注射到鹌鹑种蛋X期胚盘下腔,处理种蛋110枚,封口后孵化。出壳9只G0代,出壳率为8.18%。经检验6只鹌鹑中有4只为阳性,阳性率为66.67%。对成年的4只转基因鹌鹑中的1只内脏组织进行PCR分析以及切片荧光检测,证实外源基因在G0代成年鹌鹑组织中成功表达。将3只成年转基因鹌鹑分别与野生型鹌鹑进行杂交,得到G1代阳性率分别为33.96%、20.59%、10%。再将3只成年转基因公母鹌鹑之间进行杂交,得到G1代阳性率分别为10.87%、42.86%。证实利用脂质体转染胚盘细胞制备转基因鹌鹑是可以将外源基因整合到G0代生殖系中,且外源基因能遗传给后代。     

脂质体转染胚盘细胞制备携pEGFP—C2基因的转基因鹌鹑

利用脂质体转染第X期胚盘细胞的方法将外源质粒pEGFP—C2经脂质体包裹后注射到鹌鹑种蛋X期胚盘下腔,处理种蛋110枚,封口后孵化。出壳9只G0代,出壳率为8．18％。经检验6只鹌鹑中有4只为阳性,阳性率为66．67％。对成年的4只转基因鹌鹑中的1只内脏组织进行PCR分析以及切片荧光检测,证实外源基因在G0代成年鹌鹑组织中成功表达。将3只成年转基因鹌鹑分别与野生型鹌鹑进行杂交,得到G1代阳性率分别为33．96％、20．59％、10％。再将3只成年转基因公母鹌鹑之间进行杂交,得到G,代阳性率分别为10．87％、42．86％。证实利用脂质体转染胚盘细胞制备转基因鹌鹑是可以将外源基因整合到G0代生殖系中,且外源基因能遗传给后代。     

鸡胚胎干细胞的分离和培养

实验从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μL/mL非必需氨基酸以及含1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)和5ng/mL干细胞生长因子(SCF)的高糖DMEM对细胞进行培养和传代,可以获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞(ES)。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。同时通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。     

鸡胚胎干细胞分离培养和单细胞克隆的制备

从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2％的鸡血清、2mmol／L L-谷氨酰胺、1mmol／L丙酮酸钠、5．5&#215;10^-5mmol／L β-巯基乙醇、10μL／mL非必需氨基酸、以及含1000U／mL LIF、10ng／mL bFGF和5ng／mL SCF的高糖DMEM对细胞进行培养和传代。利用鸡第X期的胚胎干细胞,采用口吸管法、细胞稀释法和克隆环法3种方法,制备单细胞克隆,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物。结果显示,可获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。口吸管法、细胞稀释法和克隆环法单细胞克隆形成率分别为0、4.2％和1．0％。经AKP活性和SSEA-1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖不分化。结果表明,细胞稀释法操作简单易行,试验时间短,对细胞伤害小,为鸡ES单细胞克隆进一步建系提供了可行的方法。     

美国培育出鸡蛋中含体蛋白的转基因鸡

两家美国公司最近分别宣布，他们研究出了培育鸡蛋中含人体蛋白的转基因鸡的新方法。这一研究成果表明，通过鸡生蛋而“生”出药物是可行的。 　　美国密歇根州的基因工程公司近日披露，他们已培育出了 50－ 60只转基因鸡，其中一部分携带有一种可使其产下的蛋中产生人类生长因子；另一部分转基因鸡产下的蛋中含有一种可抗感染的人体抗体。而美国佐治亚州的阿维吉尼公司最近也宣布，它们培育出了产下的蛋中含有人体干扰素的转基因鸡。 　　这两家公司在培育转基因鸡过程中，主要是用没有毒性的病毒作为载体，将控制人体蛋白质产生的人体基…     

美国培育出鸡蛋中含体蛋白的转基因鸡

两家美国公司最近分别宣布，它们研究出了培育鸡蛋中含人体蛋白的转基因鸡的新方法。这一研究成果表明，通过鸡生蛋而“生”出药 物是可行的。 美国密歇根州的基因工程公司近日披露，他们已培育出了５０—６０只转基因鸡，其中的一部分携带有一种可使其产下的蛋中产生人类生长因子；另一部分转基因鸡产下的蛋中含有一种可抗感染的人体抗体。而美国佐治亚州的阿维吉尼克斯公司最近也宣布，它们培育出了产下的蛋中含有人体干扰素的转基因鸡。 这两家公司在培育转基因鸡过程中，主要是用没有毒性的病毒作为载体，将控制人体蛋白质产生的人体基…     

鸡胚胎体外操作技术的研究现状和进展（续）

5嵌合体鸡的生产　　嵌合体制作最早主要用于发育生物学、细胞遗传学等学科的理论研究。目前，禽类嵌合体的制作中作供体细胞用的囊胚层细胞(BC)和原生殖细胞(PGCs)可以代替受精卵和早期胚胎用于体外遗传操作，已成为禽类转基因研究的一个热点。同时，BC和PGCs还可以在体外进行培养和冷冻保存。基本原理是经过遗传操作的BC细胞或PGCs细胞作供体，嵌合到受体胚胎中。如果是嵌合在生殖细胞，则该嵌合体性成熟后可产生一定比例经过遗传操作的配子。　　有关鸡嵌合体方面的报道及鸡嵌合体制作方法、嵌合体的嵌合程度的判断以及怎样提高嵌…     

美国培育出鸡蛋中含体蛋白的转基因鸡

两家美国公司最近分别宣布，他们研究出了培育鸡蛋中含人体蛋白的转基因鸡的新方法。这一研究成果表明通过鸡生蛋而“生”出药物是可行的。 　　美国密歇根州的基因工程公司近日披露，他们已培育出了 50～ 60只转基因鸡，其中一部分携带有一种可使其产下的蛋中产生人类生长因子；另一部分转基因鸡产下的蛋中含有一种可抗感染的人体抗体。而美国佐治亚州的阿维吉尼公司最近也宣布，它们培育出了产下的蛋中含有人体干扰素的转基因鸡。 　　这两家公司在培育转基因鸡过程中，主要是用没有毒性的病毒作为载体，将控制人体蛋白质产生的人体基因“…     

鸡X期胚盘细胞电转染外源基因条件的探索

以EGFP为报告基因体外电穿孔转染鸡X期胚盘细胞,探讨适宜电转染条件以及影响鸡ES细胞存活率和转染率因素。分离鸡X期胚盘细胞进行培养、传代及鉴定,二代细胞设定不同的电压、脉冲时间、质粒浓度、细胞密度及孵育温度等条件转染。电击后10 min,0.4%台盼蓝染色,血细胞计数板计数,计算存活率。48 h后在荧光显微镜下计绿色荧光细胞数和总细胞数,计算转染率。结果表明:电转染鸡ES细胞的最优化电压为280 v,脉冲时间为75μs,质粒浓度为20μg/mL,转染前4℃、转染后25℃(室温)或4℃各静置10 min,细胞密度调整在1×105个/mL×106个/mL,尽量使细胞处于对数生长期。电穿孔法转染鸡ES细胞是简便有效的方法,利用优化条件转染ES细胞,可以满足进一步实验的要求。     

转基因鸡的研究现状及应用前景

利用转基因技术进行鸡的抗病育种，提高其生产性能，生产药用蛋白等是当代生物技术领域研究的焦点之一。本文针对利用胚胎移植、显微注射、原生殖细胞介导、嵌合体介导、脂质体精子介导、反转录载体、多能胚胎干细胞移植几种转基因鸡的研究方法的特点，进行比较、分析，并就应用前景作了概述，为转基因技术的应用提供参考。