改良背主动脉注射法对鸡胚发育与转基因表达效率的影响

背主动脉注射是生产转基因鸡的经典方法,该方法不需换壳培养,但壳内注射技术难度大,并且无法实时观察后期胚胎发育情况。本实验对背主动脉注射法进行了改进,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)壳外注射至150枚HH 14~16期(Hamburger-Hamilton Stage 14~16)鸡胚背主动脉中,再进行换壳培养,继续孵化至出壳,观察和分析改良背主动脉注射法与传统背主动脉注射法和胚盘下腔注射法对发育8、14、18、21 d鸡胚存活率、孵化率以及EGFP阳性检出率的影响。结果表明:改良背主动脉注射组鸡胚存活率均高于传统背主动脉注射组与胚盘下腔注射组(P<0.05或P<0.01);改良背主动脉注射组的鸡胚孵化率(37%)高于传统背主动脉注射组(16%)与胚盘下腔注射组(28%)(P<0.01);荧光蛋白手电筒检测显示,改良背主动脉注射组鸡胚EGFP阳性率(17%)明显高于传统背主动脉注射组(13%)与胚盘下腔注射组(12%)(P<0.01)。综上,背主动脉壳外注射结合换壳培养提高了转基因鸡胚胎孵化率和EGFP阳性检出率,对提高转基因鸡效率具有重要价值。     

PhiC31整合酶电穿孔鸡成纤维细胞诱发位点特异性基因盒交换

旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换。本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白，利用SUMO酶切除SUMO-His标签，获得天然的PhiC31蛋白。这两种蛋白先与pBCPB+质粒在试管内共孵育进行分子重组反应。之后，先将带有attP^TT-DsRed2-attP^CT片段的“着陆点”(landing pad, LP)质粒通过电穿孔导入DF-1细胞，然后进行第二次电穿孔，将带有attB^TT-EGFP-HiBiT-attB^CT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述DF-1细胞，验证DsRed2-EGFP基因盒交换事件发生。结果显示，成功构建了原核表达载体pET-28a-SUMO-PhiC31,经IPTG诱导，该重组质粒在大肠杆菌中以可溶性方式表达SUMO-His-PhiC31融合蛋白，经亲和层析纯化，SUMO-His-PhiC31蛋白的产量达12 mg·L^-1;该融合蛋白和切除SUMO-H...