大豆悬浮细胞培养及作为外源基因转化受体的研究

以吉林小粒7号大豆品种为材料,切取无菌幼苗下胚轴诱导愈伤组织,初步建立了大豆悬浮细胞系,测定不同硼酸浓度下悬浮细胞生长变化;采用农杆菌介导法对大豆悬浮细胞进行外源GUS基因的转化,先通过不同程度的超声处理确定最佳超声时长,然后在最佳超声处理时长的基础上,探讨了硼酸浓度对转化效率的影响;最后采用PCR和Southern blot杂交对抗性愈伤做分子鉴定。结果表明:大豆悬浮细胞正常生长硼酸浓度在2.0~10 mg·L-1,过高或过低均会抑制大豆细胞正常的生长,高于100 mg·L-1时抑制作用最显著。但在转化过程中,适当增加硼酸浓度(10~30 mg·L-1)则能够提高悬浮细胞的转化效率,并且有助于转化组织的筛选,借以3 min超声的辅助作用,30 mg·L-1硼酸浓度下转化效率达到1 mg转化细胞团中含28个转化体。     

子房注射法转化五唇兰的初步研究

采用子房注射法成功地将外源DNA导入五唇兰。结果表明：外源DNA在转化植株成熟果实中种子的GUS染色率达6.7％,无菌播种后经潮霉素筛选,获得18株幼苗,每株幼苗切取幼叶及幼根进行GUS检测,均为阳性;随机挑选7株幼苗进行PCR检测,均能扩增出GUS基因和潮霉素抗性基因条带,说明外源基因已经整合到植株基因组内。子房注射法在兰科植物转基因中的成功应用,可为兰科植物育种提供一种简单高效的途径。     

刺葡萄DFR基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

本研究以从刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因，同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体，验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体，并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，经鉴定，转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织，经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织，经PCR鉴定，茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立，验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。     

卡那霉素在小麦愈伤组织遗传转化中的应用

为建立利用卡那霉素筛选的小麦遗传转化的有效体系,采用不同浓度的卡那霉素对小麦品种的幼胚愈伤组织进行处理,系统地研究了不同品种、不同愈伤组织诱导培养基、不同诱导培养时间下愈伤组织对卡那霉素筛选的反应。结果表明,不同小麦品种的愈伤组织对卡那霉素的抗性存在显著差异;同一品种不同培养条件下产生的愈伤组织对卡那霉素的反应存在显著差异;小麦品种河农827在N培养基上诱导培养14d得到的愈伤组织在含有15mg.L-1卡那霉素的分化培养基上筛选,效果较好。基因枪介导转化河农827的愈伤组织,用卡那霉素筛选得到的抗性再生苗经PCR检测,检测出12.5%的阳性株。     

小麦遗传转化中潮霉素筛选体系的建立及应用

为建立小麦遗传转化中高效的潮霉素筛选体系,以小麦品种郑麦9023的幼胚愈伤组织为材料,探讨了潮霉素浓度、处理时间、恢复培养与否对愈伤组织分化和再生的影响,并对基因枪转化的郑麦9023、邯6172、龙麦30、龙麦31的愈伤组织进行了筛选。结果表明,对小麦幼胚愈伤组织基因枪遗传转化后的筛选以50mg·L-1潮霉素处理30d为宜;恢复培养不能提高筛选阶段愈伤组织的存活率和分化率,但能提高转化后期的成苗率。经过筛选发现郑麦9023抗性愈伤和T0代抗性植株根系及花器官中均有GUS基因的表达;4个小麦品种抗性植株中潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)和候选基因PCR阳性率分别为78.95%和73.68%以上;龙麦30、龙麦31的T1代植株的候选基因PCR阳性率分别在33.33%和73.33%以上,T2代阳性率分别在71.43%和75.00%以上。     

橡胶树体胚遗传转化中早代转化胚状体的PCR鉴定

橡胶树体胚遗传转化体系已成功建立,但抗性胚状体的循环增殖可获得大量抗性胚状体的同时,其后期的继代工作繁重.本文对橡胶树基因组DNA的CTAB提取方法进行了优化,同时筛选出了适合PCR检测的胚块重量.文中建立的胚块DNA的CTAB提取方法及筛选出的1～3mg重的胚块提取的DNA量均可满足早代胚状体PCR分析鉴定,且PCR鉴定结果与胚块的GUS染色结果吻合.该方法可用于橡胶树体胚遗传转化抗性胚状体早代筛选.     

口蹄疫病毒结构蛋白P1基因转化玉米的初步研究

实验在构建口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)结构蛋白P1基因植物双元表达载体(pBI131SP1、pBI21P1和pBI121AP1)的基础上,以玉米自交系8902、340、4112的Ⅱ型胚性愈伤组织为受体,用农杆菌介导法和基因枪轰击法转化玉米,获得31株抗性再生植株.GUS染色证明外源目的基因在玉米细胞和组织中得到了表达.PCR检测、Southem blotting鉴定证实目的基因P1已整合到再生植株的基因组中,共获得了13株转基因玉米植株,首次进行了FMDV抗原基因转化玉米的研究。     

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性.     

基因枪共转化法获得玉米转基因植株的研究

通过基因枪共转化方法将磷高效利用phy基因、钾高效利用AlHAK1基因和筛选标记bar基因等外源基因导入玉米自交系H99的1 500块愈伤组织中。经PCR分析,获得79株阳性植株,其中53株为AlHAK1阳性,49株为phy阳性,23株为AlHAK1和phy阳性,单基因转化率为5.27%,双基因转化率为1.53%,共转化整合比率达到29.11%。     

农杆菌介导小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化研究

为建立和优化小麦成熟胚愈伤组织遗传转化体系,以筛选出的适合小麦成熟胚组织培养再生的普通小麦山农2618为材料,采用农杆菌介导法对其成熟胚愈伤组织进行转化,对影响转化效率的因素如侵染菌液的浓度、侵染时间、超声波处理、真空处理等进行了研究.结果表明,这些因素对小麦成熟胚遗传转化效率有很大影响.菌液侵染浓度OD600为0.8、侵染时间为60 min时转化效率最高.在此基础上辅以超声波处理、真空处理可明显提高转化效率,最高转化率可达8.1%.对转化愈伤组织和转化植株分别进行GUS染色和PCR检测,结果表明外源基因已整合到小麦基因组中.     

转基因植物中标记基因定性PCR检测方法研究

为了建立以标记基因为检测靶标的高效定性检测方法,本研究系统地分析了目前中请商业化的转基因植物中标记基因的应用频率,选取了应用频率高或在未来应用潜力大的标记基因neomycin phosphotransferasell (NPTII)、phosphinothricin acetyltransferase(PAT)、5- ...     

转移巴西橡胶树HbCBF1基因提高烟草抗寒能力的研究

通过农杆菌介导的叶盘转化法将巴西橡胶树HbCBF1基因导入到烟草中增强表达。GUS染色和PCR鉴定结果表明,外源DNA片段已成功导入并整合到烟草基因组中。选取3个烟草转基因株系用于进一步鉴定分析,分析表明,转化植株游离脯氨酸含量与对照相比,分别上升了4.2倍、3.1倍和2.5倍,叶绿素A和叶绿素B含量也明显提高。电导率法测定转化烟草的相对存活率分别为19.8%、17.5%、16.3%,高于对照植株的7.7%。以上结果表明,橡胶树HbCBF1基因能够增强非低温驯化植物烟草的抗寒能力,其机理可能是通过促进细胞内容物的积累从而提高细胞的低温防御能力。     

橡胶树尖孢炭疽菌绿色荧光蛋白（GFP）标记转化株的获得

建立了根癌农杆菌介导转化橡胶树尖孢炭疽菌(Collectotrichum acutatum)获得T-DNA插入突变体的体系:在尖孢炭疽菌孢子浓度10~6个/mL、农杆菌浓度OD_(600)=0.15～0.2后在200μmol/mL的乙酰丁香酮(AS)诱导6 h,共培养48 h.转化效率可达150～300个/10~6个分生孢子.获得的转化子通过PCR检测绿色荧光蛋白基因、Southern 杂交验证、分生孢子的荧光观察,结果表明:被测转化子基因组中确实整合了目的片段,成功获得了橡胶树尖孢炭疽菌菌株CHY-1绿色荧光蛋白标记转化子.     

橡胶树细胞悬浮系电激转化体系的初步研究

以橡胶树属种间杂交系B1(H.brasiliensis×H.nitida)的细胞悬浮系为试材,采用均匀设计结合偏最小二乘(PLS)回归,以瞬时表达率(Y1)、细胞成活率(Y2)为试验指标综合评价,以因变量最大值为优化方向,同时对两个试验指标进行回归建模。实验结果表明,正常接种后培养3 d对数期的悬浮细胞,在10μF、2 kn、1 300 V/cm的电激条件下,蔗糖浓度为0.4 mol/L的电激转化液,加入终浓度为90μg/mL的线性质粒CaMV35S-EGFP-NOS,600 mbar压强下抽真空1 min,可使细胞瞬时表达率达到0.648 1%,成活率达到56.984 7%。通过对电激转移中相关因素的优化,建立了一种适用于橡胶树悬浮细胞系较稳定的电激转移体系,为橡胶树悬浮细胞系转基因的研究提供有效方法。      

巴西橡胶树低温诱导全长cDNA文库构建

通过低温诱导处理巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)品系93-114幼嫩枝条和树叶,提取总RNA,并分离纯化mRNA.利用SMART技术合成橡胶树全长cDNA,经过Sfi I酶切后连接到pDNR-LIB载体中,得到全长cDNA文库.文库库容为1.4×106,重组率达到100%.挑取单菌落提取质粒并酶切鉴定,插入片断分布在0.3～2 kb之间,平均大小为1 kb左右,表明该文库质量合格,可用于全长基因的筛选.     

橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选

在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中,为获得可靠的基因表达结果,筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97’健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料,收集其中的胶乳,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件,综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证,筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b,其中ejf2是最佳内参基因,18S不适合作为本研究的内参基因。     

利用基因枪转化法获得受四环素调控的水稻雄性不育植株

利用基因枪法通过pTET-BI-Bar和pTATx-BN-Bin质粒分别将TetR和Barnase基因共转化粳稻品种台北309、4008S和籼稻品种D68。通过对R0代植株不同的基因进行PCR及Southern分析,结果表明,Barnase、TetR基因和控制Barnase基因的TA29-TX启动子均已整合到水稻基因组。其中,台北309和4008S分别获得了15株和6株阳性转基因植株,其外源基因转化率分别为4.5%和1.9%,其外源基因TetR和Barnase的共转化率分别为0.6%和0.3%。D68没有获得阳性转基因植株。     

茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库,经蓝白斑筛选共得到121个含有插入片段的阳性克隆。通过菌落PCR的方法分别对阳性克隆的插入片段进行扩增,结果表明,95％左右阳性克隆插入片段的大小在200-600 bp之间。随机选取25个克隆进行测序,并对所得的25条表达序列标签(EST)序列用Blastn(基本局域联配搜寻工具)检索基因文库(genbank),其中10条EST片断可找到碱基序列相似性大于80％以上的同源基因序列,其余15条EST为没有任何功能线索的未知序列。外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建和在此基础上克隆橡胶树胶乳中JA信号的候选应激基因,将为开展茉莉酸调控橡胶树胶乳代谢和橡胶生物合成的分子机理研究打下基础。     

巴西橡胶树乳管细胞中5个橡胶合成关键酶基因节律性表达研究

以巴西橡胶树无性系PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79的未开割树为材料,采用荧光定量PCR技术,分析乳管细胞中HMGR1、FDPS、SRPP、REF和HRT2等5个橡胶生物合成关键酶基因的昼夜表达模式。结果表明：5个基因的表达均具有节律性,而且不同基因在同一无性系中以及同一基因在不同无性系间的节律性表达模式都有一定程度的差异。结果为分析不同环境因素对橡胶生物合成相关酶基因节律性表达的影响具有一定参考价值。     

橡胶树转基因植株遗传稳定性分析

以GUS染色为阳性的抗性胚状体继代再生植株的叶片为材料,通过PCR分析结合GUS染色对橡胶树转基因植株进行初期的阳性鉴定.结果表明,在59份转基因再生植株中,两对特异引物的PCR扩增结果与GUS染色检测结果一致,其中37株仍然表现为阳性,而22株却检测不到目的基因的存在以及GUS基因的表达,表现为外源基因的丢失.因此,初步推测低选择压造成了早期阳性胚状体在长期的连续继代培养再生植株的过程中发生了外源基因的丢失现象,并结合现有的研究提出了初步的解决措施.