质粒载体表达抑制猪瘟病毒shRNA在猪胚胎成纤维细胞上的复制

以质粒pSilencer3.1Hygro为基础,构建了针对猪瘟病毒Npro基因和NS4A基因mRNA的siRNA双表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞后,在潮霉素B的筛选压力下,获得5株稳定整合shRNA表达盒的猪胚胎成纤维细胞克隆.以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72 h后对感染细胞克隆进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的5株细胞克隆中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖明显降低,表明所构建siRNA双表达载体转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制.本试验为研究猪瘟病毒的防治和通过RNAi建立猪的抗病育种提供了新的方法.     

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。     

科技进展

转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立及抗猪瘟病毒转基因猪的构建构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病     

单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立

分别用原核表达的猪瘟病毒（CSFV）主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出5株稳定分泌CSFV抗体的杂交瘤细胞株1E2、1G7、3A2、3B7和4B6.间接免疫荧光和Western-blotting试验结果表明,5株单抗均与CSFV E2蛋白和全病毒抗原反应.将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板（捕捉抗体）,与兔抗CSFV IgG（检测抗体）联合应用,建立起CSFV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法.随后采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适工作浓度及判定检测结果的OD450临界值.最后以建立的AC-ELISA检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品,结果表明,该方法敏感、特异、重复性好,与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%.     

载体介导的shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖特性的研究

利用生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的干扰序列,化学合成这些序列,然后退火连接为双链干扰片段,再定向克隆到干扰载体中,将酶切和序列测定鉴定正确的重组载体命名为pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3、pGene-NS3-Negative。重组干扰载体经纯化后转染PK-15细胞,并进行G418抗性筛选。克隆细胞扩大培养后,接种猪瘟病毒Shimen株,收集细胞分别进行实时定量PCR和ELISA光吸收度分析。Real-time PCR分析表明,与对照细胞比较,pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3转录产生的shRNA分子均在一定程度上沉默了病毒的基因,抑制率约为63%、46%、49%。ELISA检测结果表明,转染pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3重组载体的PK-15细胞均在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。     

细胞亲环蛋白A对猪瘟病毒增殖的影响

细胞亲环蛋白A(CyPA)在多种病毒感染中起重要的调控作用。本实验室前期蛋白质组学研究表明,猪瘟病毒(CSFV)感染PK-15后细胞的CyPA明显上调表达。为研究CyPA在CSFV增殖中的作用,本研究首先采用环孢素A(CsA)处理PK-15细胞,特异性地抑制CyPA顺反异构酶活性,观察对CSFV的影响,在CsA处理后24 h、48 h、72 h收集细胞和细胞冻融上清,进行病毒基因组拷贝数和病毒滴度测定。结果表明CsA处理能够抑制CSFV在PK-15细胞中的增殖。同时,采用RNA干扰方法,下调PK-15细胞中CyPA的表达,结果也能够抑制CSFV在细胞中的增殖。本研究结果证明CyPA对CSFV在PK-15细胞中的增殖具有调控作用,对进一步阐明CSFV与宿主细胞蛋白的相互作用具有重要意义。     

猪瘟病毒感染细胞中分子伴侣Jiv基因的表达检测与分析

Jiv蛋白是与猪瘟病毒(CSFV)细胞内复制密切相关的伴侣分子,为探究Jiv在CSFV感染细胞内的表达规律,应用实时荧光定量RT-PCR分别对3个猪源细胞株(SUVEC、PK-15、ST)在感染CSFV后不同时间Jiv和CSFV基因表达进行检测,分析两者的相关性。结果显示,3种猪源细胞株的Jiv和CSFV的基因在0~72h的表达逐步上调,72h~96h出现下降,二者变化趋势基本一致;此外,Jiv基因在0~48h上调幅度较其他时间段更为显著,ST细胞在不同时间段的Jiv表达均高于同时段的其他两种细胞,与ST细胞中CSFV复制趋势一致。结果表明,在CSFV感染细胞中Jiv基因的表达与CSFV复制呈正相关,即CSFV复制水平越高,Jiv基因表达水平也越高。本研究初步探明细胞Jiv蛋白在CSFV复制中的调节作用,为进一步明确Jiv蛋白参与CSFV复制的机制提供了新的资料。     

转录靶向猪瘟病毒3''''-UTR shRNA细胞株的初步建立

利用质粒载体在细胞内转录并加工成siRNA的方法，设计3对针对猪瘟病毒3＇-UTR不同位点的干扰片段，分别与干扰载体pGenesil-1连接，转化DH5a，筛选阳性克隆得到重组干扰质粒pGene-1，pGene-2和pGene-3，脂质体介导转染重组干扰质粒于PK-15细胞，G418抗性筛选得到转录靶向猪瘟病毒3＇-UTRshRNA的PK-15细胞株，为今后应用RNAi研究猪瘟病毒Y-UTR调控病毒复制的功能以及抑制猪瘟病毒增殖的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒一步法RT PCR检测方法的建立

本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA，经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法，RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份，阳性检出率为92.3%；结果表明，建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

血红素加氧酶1对猪瘟病毒复制的影响

本实验研究了猪血红素加氧酶1对猪瘟病毒(CSFV)在PK-15细胞中复制的影响,本研究应用siRNA干扰方法抑制PK-15细胞中血红素加氧酶1表达后再接种CSFV,细胞中CSFV基因组增殖与对照组相比显著下降;感染病毒细胞中和培养上清中CSFV滴度也显著降低。本实验首次报道了干扰细胞中HO-1表达对CSFV细胞中增殖的影响,提出了CSFV与血红素加氧酶1新的相互作用关系。     

中国调解制度从传统模式到现代模式的延伸及其对策

中国传统的调解制度在促进纠纷解决机制的多样化发展中扮演了很重要的作用。随着现代社会发展中权利意识的苏醒、主流信仰的偏移和调解协议效力的微弱,当人们将传统调解机制遗忘并寄予诉讼来解决所有纷争时,诉讼的弊端却也开始显现出来。由此,建立ADR模式的诉前调解机制,使传统调解制度在现代法治中得以延伸就成了一种必要而可能的现实选择。     

如何训练犬接飞盘?

随着养犬水平的不断提高,很多养犬爱好者已经从简单的养、爱,发展为训、和犬一起运动,而犬接飞盘运动正是以其鲜明的特点和特色,吸引了越来越多的养犬爱好者。下面我将根据近几年的经验,就如何从幼犬开始培育犬接飞盘谈一些体会。     

试论破解中国“调猪”向“调肉”转变困境的方法

文章论述了"调猪"向"调肉"转变的历史背景,进行了冷却肉代替常温鲜肉的可行性论证,加强对冷却肉营养价值高,口味几乎与常温鲜肉媲美等关于冷却肉的知识宣传,让冷却肉成为肉类消费主流产品,是破解"调猪"向"调肉"困境的主要方法。尖锐指出目前排名前十的猪企纷纷布局的,大城市大型屠宰和肉联厂项目,是走"调猪"的老路和死胡同,会造成极大的资源浪费。提出在生猪主产区建立肉联厂,充分利用和整合现有肉联厂资源,配齐官方兽医,加强产地检疫和屠宰检疫,加快非洲猪瘟快速检测试纸的研发,加强冷却肉加工、质量控制技术研究和国家标准的制订,中国肉类加工企业协会,承接国家主管部门移交的肉类加工社会管理职能等建议,供同行参考。     

蜜蜂基因组测序完成后的启示

作为影响全球生态系统的主要授粉昆虫及用来研究生物社会行为和人类各类健康问题的模式生物,蜜蜂基因组测序已顺利完成。研究人员通过将蜜蜂基因组与其它两种已测序完成的模式昆虫基因组进行比较,得出一些重要的发现。各大媒体对此竞相报道,为了让读者对此有更深入准确的了解,我刊特约了李建科教授的这篇文章。     

狠抓技术创新提高原种质量

“东桑西移”为云南蚕业的发展带来了千载难逢的机遇。为了充分发挥推动和服务好云南蚕桑业持续健康发展的作用，以科学发展观为指导，认真贯彻执行桑蚕原种国家标准，不断地改革探索桑蚕原种生产的新技术，大力提高原种质量，为大量生产一代杂交种提供了量足质优的桑蚕原种，促进全省蚕桑产业稳步发展。现谈谈生产优质桑蚕原种的一些关键技术环节。     

加强协会建设为行业发展服务

全国饲料行业优秀职业技能站暨先进个人经验交流会 2 0 0 3年 1 2月 1 1日在昆明召开 ,中国饲料工业协会秘书长刘同占参加会议并接受当地媒体《云南饲料》的采访 ,他就如何加强协会建设 ,饲料工业发展中存在的问题和前景谈了自己的看法。我刊略作删改 ,现予发表 ,以飨读者。