进口猪产品中莱克多巴胺残留的快速检测

应用经验证可靠的ELISA方法,对进口猪产品进行莱克多巴胺残留快速筛选检测,对ELISA检测阳性的样品采用色谱质谱联用分析方法进行确证检测。1330份猪产品的检测结果显示,采用ELISA方法检出阳性率达11．4％（152／1330）;对ELISA阳性样品采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC—MS／MS）或气相色谱-质谱方法（GC—MS）确证,阳性率达90．8％（138／152）。检测工作表明,综合运用快速筛选检验技术与确证检测技术可实现快速准确检测动物产品中莱克多巴胺残留,提高进出境检验工作效率。     

高效液相色谱-串联质谱法研究猪毛发中克仑特罗和莱克多巴胺的残留及代谢规律

建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时检测猪毛发中克仑特罗和莱克多巴胺残留的方法。猪毛发经1 mol/L氢氧化钠溶液水解、乙酸乙酯萃取、MCX固相萃取柱净化,流动相溶解后用HPLC-MS/MS进行检测。克仑特罗在1.9～463.2 ng/mL浓度范围内线性关系良好(R2=0.999 0);回收率为83.3%～86.6%,相对标准偏差为6.7%～9.2%;检出限为0.3μg/kg,定量限为0.8μg/kg。莱克多巴胺在2.8～562.9 ng/mL浓度范围内线性关系良好(R2=0.999 2);回收率为83.4%～88.4%,相对标准偏差为7.2%～9.6%;检出限为0.4μg/kg,定量限为1.2μg/kg。应用该方法研究了克仑特罗、莱克多巴胺在猪毛发中的代谢规律并进行了猪毛发样品检测。结果喂药7 d至停药21 d猪毛发中均检出克仑特罗、莱克多巴胺残留;检测猪毛发样品25份,1份样品检出克仑特罗,残留量为58.68μg/kg。     

液相色谱-串联质谱法测定猪肉中3种β-受体激动剂类药物残留

试验建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测猪肉中的克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺残留的方法,并对方法进行了优化。样品经0.2 mol/L的乙酸铵缓冲液提取,加入β-葡萄糖醛苷酶进行酶解,提取液经PCX柱进行净化,液相色谱-串联质谱进行测定,内标法定量。结果显示,猪肉中3种β-受体激动剂残留浓度在0.2~10 μg/kg范围线性关系良好,线性相关系数分别为0.9997、0.9999和0.9993,定量检出限均为0.5 μg/kg,回收率分别为93.57%~96.63%、92.35%~96.01%和91.66%~96.54%,该方法灵敏度高、重现性强,适用于猪肉组织样品中克仑特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺的确证检测。     

动物组织中莱克多巴胺残留胶体金免疫层析和LC-MS/MS检测方法的比较

采用胶体金试纸卡法和LC-MS/MS法分别对猪肉、猪肝样品进行检测,鉴定胶体金试纸卡法和LC-MS/MS法检测结果的符合率。结果表明：应用胶体金试纸卡法检测样品中莱克多巴胺的最低检测限为5.0μg/kg,LC-MS/MS检测方法的检测限为0.25μg/kg;2种方法的检测结果一致。胶体金试纸卡法特异性较高,样品前处理简单,检测快速,成本低,适用于动物组织中莱克多巴胺残留的定性筛查;LC-MS/MS灵敏度高,适合于阳性样品的确证和精确定量。     

气相色谱-质谱法同时测定猪肝中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺残留

猪肝用乙酸乙酯、盐酸溶液提取后，经SCX固相萃取柱净化、BSTFA衍生化，定容后用气相色谱-质谱（GC／MS）外标法测定。测定结果表明：采用该方法，猪肝中盐酸克伦特罗和莱克多巴胺的检出限分别为0．3、1．0ng／g。盐酸克伦特罗在3．0～300ng／mL范围内与峰面积具有良好的线性关系，平均回收率为85．6％；莱克多巴胺在10～1000ng／mL范围内与峰面积具有良好的线性关系，平均回收率为76．6％。该方法简便可靠、干扰小、灵敏度高，可用作猪肝中克伦特罗和莱克多巴胺残留的同时测定。     

深圳市龙岗区生猪尿样中莱克多巴胺残留调查与分析

莱克多巴胺属于β-兴奋剂,在动物产品中残留量过高会危害人类健康,本试验采用酶联免疫法检测龙岗区屠宰生猪尿样中莱克多巴胺的残留,经检验辖区生猪102份样品全为阴性,非辖区生猪102份样品,6份阳性,阳性率达5.9%,分析并建议加强对莱克多巴胺的监管.     

4种市售莱克多巴胺检测试剂盒的质量评价

<正>莱克多巴胺的残留检测目前常用的检测方法有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用及酶联免疫检测法等,试验旨在通过对不同莱克多巴胺ELISA试剂盒质量评价与检测研究,为莱克多巴胺监测试剂盒的使用提供科学的参考数据。     

“瘦肉精”现场快速检测的应用及分析

使用"瘦肉精"快速检测卡,对深圳市某定点屠宰场待宰猪、牛、羊进行"瘦肉精"现场快速检测,用盐酸克伦特罗检测卡检测猪尿82258份、用莱克多巴胺检测卡检测猪尿82258份、用沙丁胺醇检测卡检测猪尿82258份,用盐酸克伦特罗检测卡检测牛尿20561份、用莱克多巴胺检测卡检测牛尿20561份、用沙丁胺醇检测卡检测20561份,用盐酸克伦特罗检测卡检测羊尿6443份、用莱克多巴胺检测卡检测羊尿6443份、用沙丁胺醇检测卡检测羊尿6443份。检测结果:盐酸克伦特罗快速检测为阳性的猪尿有3份、牛尿96份;莱克多巴胺快速检测为阳性的猪尿有2份;沙丁胺醇快速检测为阳性的牛尿12份。对现场快速检测结果为阳性的尿样送第三方检测机构使用液相色谱-串联质谱法进行复检确证,确证结果:盐酸克伦特罗检测卡假阳性率为6%,莱克多巴胺检测卡假阳性率为0,沙丁胺醇检测卡假阳性率为8%。     

高效液相色谱-四极杆质谱联用测定猪尿液中菜克多巴胺残留

采用自动固相萃取装置和Agilent HP1100高效液相色谱-四极杆质谱联用仪，优化质谱分析条件，建立猪尿中莱克多巴胺残留检测方法。方法的线性范围为0．010～0．200μg／mL，相对标准偏差在3．4％～5．8％之间，回收率在74．5％～94．2％之间，具有较好的准确度和精密度。     

加速溶剂萃取-固相萃取-气相色谱-质谱法测定饲料中三聚氰胺残留

研究旨在建立一种饲料中三聚氰胺残留测定的加速溶剂萃取-固相萃取-气相色谱-质谱方法。饲料样品经加速溶剂萃取仪提取,固相萃取净化后,气相色谱-质谱法(GC-MS)测定。筛选并优化了饲料中三聚氰胺残留的提取试剂、提取方法,确定了加速溶剂萃取仪工作条件,筛选了高效、适用的色谱柱,并确定了色谱、质谱条件。结果表明,加速溶剂萃取方法对阳性样品的提取效果显著优于超声萃取法,选用甲醇水溶液(V V=1 4)替代腐蚀性较强的10%三氯乙酸溶液,萃取效果好且不易腐蚀加速溶剂萃取仪,HP-5MS色谱柱分离效果优于DB-35MS色谱柱。采用本方法,提取效率高,且方法简便、快速,能满足饲料中三聚氰胺残留检测的需要,显著优于NY/T 1372—2007《饲料中三聚氰胺的测定》标准中采用的超声萃取法。     

Development and Evaluation of an Indirect ELISA for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus IgA in Pig Serum and Milk Captured by Monoclonal Antibody

For the rapid and accurate evaluation of the IgA antibody level of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in pig serum and milk,a specific PEDV IgG monoclonal antibody (MAb) 8A3 was screened from four strains of PEDV MAb,which could capture all virus particles (inactivated virus cell culture medium) of PEDV efficiently.In this method,the coating concentration of 6.0 μg/mL showed the optimal performance of MAb 8A3,the cut-off value (D_{450 nm}) was settled as 0.34,it had no cross-reactivity with the positive serums of common porcine viruses.Compared with immune-peroxidase monolayer assay (IPMA),the concordance rates of established ELISA for positive and negative serum detection were 98.7% (152/154) and 98.0% (145/148),respectively.For positive and negative samples of colostrum and milk,the concordance rates of the established ELISA compared with IPMA were 100% (60/60) and 95.8% (23/24),respectively.IgA levels in colostrum and milk samples during lactation detected by established ELISA were highly correlated with trends in neutralizing titers (kappa=0.835).Collectively,the indirect ELISA in this study had high sensitivity and specificity,it was a rapid and objective method suitable for large-scale detection of PEDV IgA in clinical samples.     

市售猪肉及其组织中"瘦肉精"残留调查

采用德国r-Biopharm拜发公司试剂盒，用竞争性EUSA法对某市13个菜场共抽取40份瘦肉、30份猪肝、18份猪肾脏、30份猪肺、15份猪骨和30份猪血、30份猪毛，总计样品进行了瘦肉精残留检测。结果表明，在抽检的193份样品中共有38份瘦肉精含量大于1．0ng／g，占总数的19．7％，其中猪肝与猪毛的检出率最高。同时在瘦肉精含量大于1．0ng／g的样品中抽取9份，用GC／MS／MS法确证，结果与ELISA法相符。     

基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明¹⁴⁶PAEPYTT¹⁵²为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2 μg·mL^-1),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05% PBST溶液稀释5 000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1 600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。     

QuEChERS-dSPE-UPLC-MS/MS筛查中药材地龙中41种兽药残留

建立了基于超高效液相色谱串联三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)的动态多反应监测模式(d-MRM)快速筛查中药材地龙中7大类(喹诺酮类、磺胺类、糖皮质激素类、硝基咪唑类、抗病毒类、非甾体抗炎类、镇静安眠类)41种兽药残留的分析方法。样品采用QuEChERS提取,分散式固相萃取管(dSPE EMR-Lipid)进行净化,采用d-MRM采集模式进行定性和定量检测,外标法定量,41种兽药测定在各自线性范围呈良好的线性关系,相关系数(R 2)均大于0.9917,检出限为0.1000~3.105μg/kg,定量限为0.3184~7.532μg/kg,3个添加水平的回收率为62.8%~112.3%,精密度为1.1%~8.9%。该方法前处理简单、重现性好、灵敏度高,适用于中药材地龙中41种兽药残留的快速筛查。     

基于E^rns蛋白的猪非典型瘟病毒间接ELISA检测方法的建立

猪非典型瘟病毒(APPV)是新近发现的仔猪先天震颤的病原体,其血清学检测方法亟待建立.E^rns蛋白是APPV诱导机体产生中和抗体的重要保守性抗原,是血清学检测的特异性靶标之一.本研究制备了猪非典型瘟病毒原核表达的Erns蛋白,以其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法.结果表明,最佳抗原包被浓度为8μg/mL,最佳血清稀释度为1:10,阴阳性临界值D450=0.318,灵敏度达到1:64,特异性好,与猪瘟、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流感及圆环病毒病的阳性血清均不发生交叉反应.该检测方法重复性好,批内变异系数最大值为7.84%,批间变异系数最大值为8.57%.利用建立的间接ELISA方法对50份猪临床血清样本进行了检测,其阳性率为10%.基于Erns蛋白间接ELISA检测方法的建立为APPV的流行病学调查和临床诊断提供了有效的工具.     

动物源性食品中莫能菌素残留ELISA试剂盒的研制

利用碳化二亚胺法合成抗原,进行动物免疫,制备特异性强的单克隆抗体。在筛选莫能菌素单克隆抗体的基础上,建立了莫能菌素ELISA检测方法,并研制出利用单克隆抗体对动物源性食品中残留的莫能菌素进行检测的试剂盒。本试剂盒的最低检测限为1μg/kg,试剂盒标准品变异系数为5.4%～13.1%,肌肉、肝脏样本的变异系数为5.1%～14.2%,肌肉和肝脏样本添加回收率分别为67.5%～87.4%和64.7%～86.7%。该方法的建立为莫能菌素的残留检测提供了可靠的分析检测手段。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因编码区序列,分别设计合成3组引物,通过对引物的筛选和反应条件优化,建立了PEDV RT-LAMP可视化快速检测方法。灵敏度和特异性试验结果显示,本方法在65℃45 min对PEDV的检测灵敏度为2 copies/μL,与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应。利用该方法对30份送检的临床样品进行检测,检出阳性样品8份,与荧光定量RT-PCR检测结果一致。试验表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视、设备适用范围广等优点,适用于PEDV现场快速检测。     

Establishment and Application of an Indirect ELISA with Recombinant N Protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

To establish a sensitive,specific and efficient method of antibody detection for porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV),PRRSV N protein was expressed through prokaryotic expression system and purified by affinity chromatography to act as a coating antigen.Then an indirect ELISA detection method for serum PRRSV antibody was finally set up after the optimization of reaction conditions.Besides,the research also involved cross reaction,repeated experiments,and comparison with other ELISA kits.It was determined that the optimum concentration of coating antigen was 2 μg/mL and that the dilution ratio for serum was 1:100,with 30 min of incubation and 10 min of chromogenic reaction.With this method,positive serum samples of five common swine pathogens,including classical swine fever virus（CSFV),porcine circovirus（PCV）and porcine pseudorabies virus（PRV）and so on,were tested,and the results were negative.Both intra-assay and inter-assay coefficients of variation were below 10%,and the comparison with commercial ELISA kits indicated that its accuracy was 94.7%.So this indirect ELISA,which had been established in this research,could provide a rapid diagnosis for swine infected by wild PRRSV and applied in epidemiological investigation,as a convenient and efficient serological antibody detection method.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30 min,显色时间为10 min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。