红肉蜜柚CgCYP86A8L基因克隆与表达分析

从红肉蜜柚(Citrus grandis)果实汁胞中分离CYP86A8L基因全长cDNA,对其序列进行分析，并应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测不同发育阶段果实中CgCYP86A8L基因的转录水平。结果表明：红肉蜜柚CgCYP86A8L cDNA全长1 623 bp,编码541个氨基酸，与甜橙CYP86A22L序列的相似度达99%;其编码的氨基酸序列C端包含保守的血红素结构域；随着果实发育，CgCYP86A8L基因在汁胞中的表达急剧下降。推测，CgCYP86A8L基因可能在红肉蜜柚果实发育早期中起到十分重要的作用。     

黄瓜果实弯曲相关基因Cs14-3-3 的克隆及表达分析

 以黄瓜（Cucumis sativus L.）果实易发生弯曲的品种‘长春密刺’为试验材料,采用RT-PCR 技术从果皮中分离并克隆了14-3-3 蛋白基因,并将此基因命名为Cs14-3-3。Cs14-3-3 基因cDNA 全 长792 bp,编码263 个氨基酸,分子量29 589.287 Da,等电点为4.585。生物信息学分析表明此基因含有 14-3-3 蛋白基因的典型结构域,与其他物种14-3-3 蛋白基因核苷酸序列同源性达到75%以上,编码的氨 基酸序列同源性达到85%以上,属于14-3-3 蛋白基因家族。同时,采用实时荧光定量PCR 方法对顺直果 实和弯曲果实腹部及脊部在果实开花的2、4、6、8、10、12 d 的基因表达量进行了研究。结果显示,在 果实发育各个时期,Cs14-3-3 的表达量均为在弯曲果实腹部 > 顺直果实 > 弯曲果实脊部的表达量;在 各个部位,Cs14-3-3 在果实开花2 d 的表达量明显高于开花后其他时期。试验结果表明,Cs14-3-3 基因为 黄瓜果实弯曲相关基因,在黄瓜果实开花早期发育过程中起重要作用。     

果实CCoAOMT与LAR基因的筛选与表达分析

以果实为研究材料,探讨了PsCCoAOMT和PsLAR基因在果实不同发育时期的表达动态,采用两步法逆转录与抑制PCR技术相结合的方法构建含果实不同发育时期的均一化全长cDNA文库,通过稀释池PCR法筛选出酚类物质代谢途径中的关键酶基因PsCCoAOMT和PsLAR。结果表明:PsCCoAOMT和PsLAR全长cDNA序列分别为1 195bp和1 625bp,对应的ORF分别为744bp和1 050bp,分别编码247和349个氨基酸。PsCCoAOMT相对分子量为27 893.8,等电点为5.42,属于亲水性稳定蛋白;PsLAR相对分子量为38 483.1,等电点为5.40,具有亲水性,属于不稳定蛋白。同源性分析表明,PsCCoAOMT氨基酸序列与白梨相似性达96%,PsLAR氨基酸序列与蔷薇科植物高度同源。荧光定量结果表明,PsCCoAOMT在整个生长发育过程表达量差异都不明显,整体呈下降趋势,花后50d表达量最低;PsLAR在整个生长发育过程表达量呈明显的下降趋势,前期高后期低,花后125d表达量最低。     

金针菇异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆及表达分析

PCR扩增了金针菇(Flammulina velutipes)异戊烯基焦磷酸异构酶基因(FvIDI)的DNA全长和开放阅读框序列.该基因的ORF全长753 bp,DNA全长923 bp,含有3个内含子和4个外显子,编码250个氨基酸,金针菇异戊烯基焦磷酸异构酶相对分子质量为28450,等电点为5.05.采用实时荧光定量PCR技术研究FvIDI基因在不同发育时期和不同温度下的表达量,结果显示,FvIDI基因在采收期菌盖中表达量最高,4℃诱导处理2～4 h和37℃诱导处理2～6 h的表达量明显高于常规温度21℃处理.     

百合肌动蛋白基因lilyActin 的克隆与表达分析

 为了在百合功能基因表达研究中选择一个理想内参基因,依据岷江百合cDNA 文库所获得的百合肌动蛋白（Actin）基因的EST 序列,采用RACE 技术进行该基因cDNA 全长克隆,并利用实时荧光定量PCR 分析其在不同组织中的表达模式,获得百合肌动蛋白基因cDNA 全长序列（GenBank 登录号：JX826390）,命名为lilyActin。该基因cDNA 全长1 367 bp,其中,5′非编码区91 bp,3′非编码区233 bp,开放读码框1 134 bp,编码377 个氨基酸。序列比对发现,该基因与其它15 种植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性达98%。进化分析显示,百合肌动蛋白与郁金香肌动蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 结果显示,该基因在百合的花蕾、叶片和鳞片组织中恒定表达,表明相对于其他物种的内参基因,lilyActin 更适宜作为百合属植物的内参基因。     

(木奈)果实CCoAOMT与LAR基因的筛选与表达分析

以(木奈)果实为研究材料,探讨了(木奈)PsCCoAOMT和PsLAR基因在(木奈)果实不同发育时期的表达动态,采用两步法逆转录与抑制PCR技术相结合的方法构建含(木奈)果实不同发育时期的均一化全长cDNA文库,通过稀释池PCR法筛选出酚类物质代谢途径中的关键酶基因PsC-CoAOMT和PsLAR.结果表明:PsCCoAOMT和PsLAR全长cDNA序列分别为1 195 bp和1 625 bp,对应的ORF分别为744 bp和1 050 bp,分别编码247和349个氨基酸.PsCCoAOMT相对分子量为27 893.8,等电点为5.42,属于亲水性稳定蛋白;PsLAR相对分子量为38 483.1,等电点为5.40,具有亲水性,属于不稳定蛋白.同源性分析表明,PsCCoAOMT氨基酸序列与白梨相似性达96％,PsLAR氨基酸序列与蔷薇科植物高度同源.荧光定量结果表明,PsCCoAOMT在(木奈)整个生长发育过程表达量差异都不明显,整体呈下降趋势,花后50 d表达量最低;PsLAR在(木奈)整个生长发育过程表达量呈明显的下降趋势,前期高后期低,花后125 d表达量最低.     

‘苹果梨’果实着色过程中PyCHI和PyF3H的克隆与表达分析

【目的】克隆‘苹果梨’(Pyrus bretschneideri Rehd.‘Pingguoli’)Py CHI和Py F3H的全长c DNA序列,检测其在果实着色过程中的表达特性及其与花青苷积累的关系。【方法】以‘苹果梨’套袋后去袋处理的果实和未套袋的果实(CK)为试材,采用同源克隆技术克隆Py CHI和Py F3H的全长c DNA序列并进行生物信息预测分析;利用实时荧光定量PCR技术检测Py CHI和Py F3H在去袋处理与未套袋处理的不同着色时期的果实中的表达特性。【结果】Py CHI和Py F3H的全长c DNA分别为702 bp和1095 bp,分别编码233和364个氨基酸。同源性分析显示,其与沙梨、西洋梨等蔷薇科梨属植物相应基因的同源性均超过95%,相应氨基酸序列相似性均达到85%。实时荧光定量PCR分析显示,套袋果实去袋见光后Py CHI和Py F3H表达量均迅速上升,随后Py CHI表达量虽然略有下降,但在整个果实着色过程中Py CHI和Py F3H的表达量一直维持在较高水平,均显著高于对照,且与果实花青苷含量的变化规律基本一致。【结论】获得‘苹果梨’PyCHI和Py F3H的全长c DNA序列,其表达水平与果实花青苷积累关系密切,表明其在调控‘苹果梨’果实着色过程中起重要作用。     

菜薹蛋白精氨酸甲基转移酶基因BrcuPRMT5的克隆及表达分析

以‘油青49’和‘油青甜菜薹80’菜薹茎尖为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得组蛋白甲基转移酶基因Brcu PRMT5的全长cDNA和gDNA序列。BrcuPRMT5 cDNA序列全长为2 117 bp,其中完整开放阅读框为1 929 bp,编码642个氨基酸,相对分子量为71.55 kD,理论等电点(p I)为5.87;多序列比对结果表明,Brcu PRMT5编码的氨基酸序列含有高等植物PRMT5基因1个高度保守的结构域;系统发育分析结果显示与大白菜、油菜及甘蓝的亲缘关系最近;亚细胞定位软件分析得知,Brcu PRMT5蛋白无跨膜区域,可能定位于线粒体中;对应的gDNA全长为4 151 bp,含有23个外显子和22个内含子,最长的外显子长度为140 bp,内含子的长度范围为50~150 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析基因的表达,BrcuPRMT5在菜薹不同组织中均有表达,其中在花中表达量最高,叶次之,根中最低;BrcuPRMT5从苗期至完全抽薹开花期的表达量呈现上升趋势。BrcuPRMT5在菜薹花发育过程中可能起一定的调控作用。     

荔枝类甜蛋白基因的克隆与表达分析

以‘妃子笑’荔枝（Litchi chinenesis）为试材,通过PCR方法克隆了荔枝类甜蛋白基因LcTLP（登录号JF682821）的cDNA全长和完整开放阅读框（ORF）对应的gDNA序列。序列分析表明：该基因无内含子,cDNA序列含有一个672 bp的ORF,编码223个氨基酸残基序列。荧光定量PCR结果表明：LcTLP在花中表达量最高,其次是果皮,在果肉中表达量最低;在果实发育过程中,果皮中LcTLP表达量先上升后下降,采后果皮中的表达量高于采前,炭疽菌侵染诱导LcTLP的表达,失水和低温能抑制LcTLP的表达。     

芜菁Br14-3-3的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆了‘津田芜菁’（Brassica rapa subsp. rapifera‘Tsuda’）通用调节因子14-3-3基因cDNA序列，命名为Br14-3-3（GenBank登录号为MK896872）。该基因全长1 113 bp，开放阅读框全长774 bp，编码含有257个氨基酸的多肽。荧光定量PCR分析Br14-3-3在‘津田芜菁’不同组织中及其在温度、脱水、渗透、ABA和无机盐等非生物胁迫下幼苗中的表达，结果表明该基因在‘津田芜菁’的花中表达量最高，幼苗中次之；低温抑制了Br14-3-3的表达，其他非生物胁迫可诱导该基因表达，暗示Br14-3-3在非生物胁迫应答中发挥功能。     

延边苹果梨PyDFR基因的克隆及表达分析

以延边苹果梨果实为试材,采用同源克隆及实时荧光定量PCR的试验方法,研究PyDFR基因在果实着色过程中的表达特性及其与花青苷积累的关系。结果表明:PyDFR基因cDNA全长1 039bp,推断其含有1个843个核苷酸的开放阅读框(ORF),编码281个氨基酸,推导的蛋白分子量为32kDa,理论等电点pI为6.32。同源性分析表明,PyDFR基因与沙梨的(JQ749637.1)DFR基因的同源性高达99%;实时荧光定量PCR分析表明,PyDFR基因受到光诱导表达量迅速上升,去袋后1d即达到最大值,随后迅速下降,最终稳定在同一表达水平,与果实着色和花色苷含量测定的结果相对应,即PyDFR基因对果实花色素苷积累有一定的促进作用。     

冬凌草异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IDI)克隆与分析

以冬凌草无菌苗为试验材料,在冬凌草转录组信息数据的基础之上,采用逆转录PCR技术克隆到冬凌草二萜类合成的关键酶基因:异戊烯基焦磷酸异构酶基因(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI),并对该基因进行了相关的生物信息学分析。结果表明:IDI cDNA基因全长1 050bp,基因开放阅读框为906bp,编码301个氨基酸,其蛋白质序列理论分子量为27.4kDa,等电点为5.06,是一种亲水性蛋白。采用实时荧光定量PCR法分析其组织表达模式,发现IDI在叶中表达量相对较高,在愈伤组织中表达量最低。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

苹果梨果皮花色素苷合成相关基因PyANS的克隆与表达分析

以延边地区苹果梨为试材,采用同源克隆及实时荧光定量PCR的试验方法,研究PyANS基因在苹果梨解袋前后果实着色过程中的表达特性及与花青苷积累的关系。结果表明:PyANS的全长cDNA为1 075bp,其开放阅读框(ORF)编码358个氨基酸,分子量约为40kDa,理论等电点pI为5.38。同源性分析表明与同属的砂梨相似性高达99%,实时荧光定量PCR分析表明PyANS基因受到光诱导表达量迅速上升,去袋1d后表达量迅速增加,第10天时达到最大值,随后迅速下降,最终稳定在同一表达水平,与果实着色和花色苷含量测定的结果相对应,表明PyANS基因对果实花色素苷积累有一定的促进作用。     

草莓9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2228bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。     

(捺)叶片β-羟脂酰-CoA脱水酶(HCD)基因全长cDNA的分离与表达研究

以(Prunus salicina Lindl.var.cordataJ.Y.Zhangetal)5个不同生长发育时期叶片为试材,根据已构建的5个不同生长发育时期叶片的均一化全长cDNA文库,分离得到了一个羟脂酰-CoA脱水酶(HCD)基因,命名为PsHCD。对PsHCD基因生物信息进行分析,同时利用Real-time PCR检测PsHCD基因在叶片中5个不同生长发育时期的表达量。结果表明:该基因的cDNA开放阅读框编码区为第322个核苷酸到第987个核苷酸,编码221个氨基酸残基,5′UTR长度为321bp,3′UTR长度为156bp。利用TMHMM server软件分析,该基因编码的蛋白质有4个跨膜区域,PSORTⅡPrediction软件分析推测,亚细胞定位于内质网、微体和溶酶体中。实时荧光定量PCR结果表明,PsHCD的表达量随着叶片生长逐渐升高,在展开叶时达到最高峰,在幼叶到成熟叶时处于一种稳定水平,随后降低,老叶表达量最低。     

龙眼胚胎F3H基因的cDNA克隆及序列分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对‘立冬本'龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分离,通过MALDI-TOF-TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮-3-羟化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F3H)。以‘立冬本’龙眼胚胎cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得F3H基因cDNA 1 404 bp全长序列。序列分析表明,F3H基因共编码365个氨基酸,其cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等F3H基因的同源性均高达80%以上,该基因在GenBank中登录号为EF468104。     

杨梅果糖激酶基因MrFRK2的克隆及在成熟期果实中的表达分析

以‘荸荠’和‘东魁’杨梅果实为研究材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆得到果糖激酶基因MrF RK2的全长c DNA序列。MrF RK2全长1 279 bp,ORF阅读框全长996 bp,3′端非编码区227bp,5′端非编码区56 bp,编码332个氨基酸残基。通过氨基酸序列分析发现Mr FRK2含有pfk B碳水化合物磷酸果糖激酶家族高度保守的1个ATP结合域和2个底物结合域;Mr FRK2与杨树Pt FRK2相似性最高,达到85%。利用实时荧光定量PCR技术分析基因表达的结果表明,Mr FRK2在‘东魁’杨梅果实的发育早期大量表达,在成熟后期表达量下降,果实成熟初期Mr FPK2表达量‘东魁’显著高于‘荸荠’。果实成熟期间果糖含量‘东魁’显著高于‘荸荠’,与果实成熟期间Mr FPK2的表达量相反。这表明,MrF PK2在杨梅果实成熟期间果糖降解过程中可能起一定作用。     

茄子甲硫氨酸亚砜还原酶（SmMsrA）基因cDNA全长的克隆和分析

 以茄子单性结实品系D-10花后7 d的单性结实果实为试材,并以在茄子单性结实抑制差减文库中差异表达的EST片段Z569为基础,利用RACE技术,获得一个934 bp的cDNA全长序列,为甲硫氨酸亚砜还原酶A基因,命名为SmMsrA。基因编码区共600 bp,编码199个氨基酸。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有甲硫氨酸亚砜还原酶基因家族结构域和保守基本序列GCFWG,与杨树甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）蛋白三级结构相似性较高,为67%。蛋白多序列比对和进化树分析表明,SmMsrA与番茄MsrA蛋白的同源性最高（92%）,进化距离最近。采用荧光定量PCR对单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2中不同结实性果实发育过程中SmMsrA的表达量进行测定,结果表明：在不同结实性的子房和果实发育过程中SmMsrA基因都有表达,单性结实品系在低温条件下开花当天子房中的SmMsrA的表达量最高。