津田芜菁BrPIP1的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆得到津田芜菁(Brassica rapa ssp.rapifera‘Tsuda’)质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)基因全长cDNA序列,命名为BrPIP1(GenBank登录号为KJ173685),全长为1 056 bp,开放阅读框为861 bp,编码286个氨基酸。荧光定量PCR分析BrPIP1在不同组织以及其在温度、脱水、渗透、ABA和盐等非生物胁迫条件下幼苗中的表达表明,该基因表达具有组织特异性,在花瓣中表达量最高,花蕾中次之;在上述非生物胁迫下表达量都有不同程度增加,暗示BrPIP1在非生物胁迫应答中发挥作用。     

津田芜菁BrEGL3 cDNA的克隆及表达分析

 EGL3（Enhancer of Glabra3）蛋白是一种bHLH类蛋白,是一类重要的转录调节因子。为阐释BrEGL3在‘津田’芜菁（Brassica campestris L. ssp. rapifera‘Tsuda’）花青素生物合成中的调控作用,根据拟南芥EGL3基因序列信息设计兼并引物,克隆获得了‘津田’芜菁EGL3基因的全长cDNA序列,命名为BrEGL3,其GenBank登录号为HM208589。序列分析结果显示,BrEGL3全长1 794 bp,包含编码597个氨基酸的开放阅读框,分子量约为66.8 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白含有DNA结合域,该结合属于螺旋—环—螺旋家族。氨基酸对比分析表明,BrEGL3与萝卜EGL3蛋白相似性最高,其次为拟南芥中的EGL3。荧光定量PCR检测BrEGL3在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在有花青素合成的红色芜菁根皮中表达量最高。     

以PMI为选择标记的露地菊转Lc-14-3-3基因体系的建立及功能鉴定

 从东北地区高pH盐碱地上生长良好的羊草中克隆Lc14-3-3基因，以露地菊（Chrysanthemum morifolium）‘火焰’叶片愈伤组织为受体，以农杆菌介导，将Lc14-3-3基因转入‘火焰’基因组中。以载体中的磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase，PMI）为筛选标记，通过甘露糖的筛选，结合PCR、Southern杂交检测Lc14-3-3整合到其基因组。通过转基因植株与对照植株的耐盐性对比可见转化Lc14-3-3基因植株具有更高的耐盐能力。磷酸甘露糖异构酶基因/甘露糖筛选系统可有效应用于露地菊遗传转化。     

草菇gpd基因的克隆、序列分析和其启动子的推测以及冷诱导对其表达方式的影响

草菇3-磷酸-甘油酯脱氢酶（GPD）基因全长1489bp,含有9个内含子。gpd全长cDNA含有1157核苷酸,包含1个编码337个氨基酸的1011 bp开放阅读框和1个95 bp 3’端非翻译区。在1220 bp的5’端侧翼区内检测到启动子元件,该元件含有2个TATA框和3个CAAT框,分别位于开始密码子ATG上游第80、559、333、340和406 bp位点。Southern杂交分析表明,草菇基因组含有1个拷贝的gpd基因。Northern杂交分析表明,gpd基因的表达不受冷胁迫诱导。     

牡丹PseIF5A基因克隆及其初步功能验证

从热激后耐热的牡丹品种‘凤丹白’中克隆到牡丹Pse IF5A,全长480bp,与葡萄的同源基因具有较高的同源性,为热激诱导表达基因。将该基因转入大肠杆菌后,重组的菌株能诱导表达该基因的融合蛋白,并提高了对高温、低温、重金属、高盐、高Ph、氧化等非生物胁迫的抗性,表明牡丹Pse IF5A能响应多种非生物胁迫。     

‘巨峰’葡萄细胞分裂素氧化酶基因CKX3的克隆与表达分析

结合同源克隆和RACE技术在‘巨峰’葡萄（Vitis labruscana Bailey × V. vinifera L.‘Kyoho’）中克隆了细胞分裂素氧化酶基因CKX3,分析了该基因的表达特性及其对细胞分裂素的响应。序列分析表明,该基因cDNA全长为2 049 bp（GenBank登录号：KP689597）,ORF（开放阅读框）为1 569 bp,编码522个氨基酸,具有FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合结构域和细胞分裂素结合结构域。该基因定位在葡萄的7号染色体上,具有4个内含子,5个外显子。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示‘巨峰’葡萄CKX3与荷花NuCKX3亲缘关系最近,与毛果杨同源性较高。基因表达分析结果显示‘巨峰’葡萄CKX3主要在根部和花序中大量表达,其次是在卷须和果实中有较高的表达,在茎和叶中的表达量较低;在花序发育过程中,在盛花期前表达量较低,盛花期以及盛花后表达量增加。在6-BA处理葡萄叶片后,CKX3的表达与细胞分裂素氧化酶的活性都高于对照。     

黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1011bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

南瓜热激蛋白相关基因CmHSP70-5 的克隆和高温胁迫下的表达分析

基于南瓜基因组序列，采用PCR 的方法从南瓜cDNA 中克隆1 个热激蛋白相关基因，命名为CmHSP70-5，采 用生物信息学方法分析该基因编码的蛋白与其同源蛋白的系统发育关系，利用荧光定量PCR 研究南瓜幼苗在高温胁迫下 CmHSP70-5 基因的表达量。结果表明：CmHSP70-5 基因全长1 953 bp，其编码的CmHSP70-5 蛋白与拟南芥AtHSP70-5 的亲缘关系最近。未经高温处理时CmHSP70-5 基因在根中的表达量要显著高于茎和叶。在高温胁迫下，根、茎、叶中 CmHSP70-5 基因均呈现上调表达，均在处理后3 h 表达量达到最大，说明CmHSP70-5 基因的表达与南瓜高温胁迫有关。     

羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

以羽衣甘蓝品种白孔雀为试验材料,通过同源克隆和RACE 方法从低温诱导的羽衣甘蓝幼苗中分离得到了羽衣甘蓝甘油-3-磷酸酰基转移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT）基因的全基因序列,采用生物学软件对该序列 进行生物信 息学分析。结果表明：该基因全长1 558 bp,推测其编码451 个氨 基酸,并命名为BaGPAT。序列分析发现,羽衣甘蓝BaGPAT 基因推导的氨基酸与已知其他植物GPAT 基因序列有54%～85% 的相似性。聚类分析结果显示：羽衣甘蓝GPAT（BaGPAT）基因与拟南芥和宽叶独行菜GPAT 基因亲缘关系较近。     

柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害，对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进行注释，并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2，确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员，根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类；CsNCED3-2其序列全长2 377 bp，开放阅读框1 830 bp，编码609个氨基酸，属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员，是非分泌性蛋白；在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点，‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’，并且两品种的相对表达变化呈相反趋势；与茎、叶和种子相比，CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高；两品种的CsNCED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE（脱落酸响应）、TCA-element（水杨酸响应）、MYC/MYB（干旱响应）等，但数量和类型存在差异。     

芹菜AgHAT4的克隆与表达模式分析

以两个芹菜品种‘六合黄心芹’和‘文图拉’为试验材料，分别克隆获得HAT4转录因子基因AgHAT4。应用生物信息学方法分别从氨基酸组成、蛋白结构与理化性质、以及系统进化树等方面对该基因进行分析。结果表明，AgHAT4含有1个长为900 bp的开放阅读框（ORF），编码299个氨基酸。‘六合黄心芹’和‘文图拉’中的AgHAT4基因有1个核苷酸位点的差异，编码的氨基酸有1个位点的差异，其蛋白质相对分子质量分别为33.71和33.68 kD，等电点均为9.12。进化树分析表明芹菜AgHAT4与胡萝卜的HAT4属于同一分支。蛋白结构预测显示，该蛋白主要由3个α螺旋和一些无规则卷曲构成，且未定位到信号肽。荧光定量PCR结果表明，AgHAT4在芹菜叶柄中的表达量最高，根中次之，叶片中表达量最低。多种非生物胁迫导致芹菜AgHAT4的表达量发生变化。与未胁迫对照相比，高温胁迫处理后‘六合黄心芹’中AgHAT4的表达量在24 h明显上调，在盐胁迫条件下‘文图拉’和‘六合黄心芹’中AgHAT4的表达有着相似的变化趋势，均先上升后下降且在处理2 h后表达量达到峰值。‘文图拉’中AgHAT4的表达量在高温处理4 h后表达量最高，而在低温条件下在处理2 h后表达量最高。     

茶树DHAR酶基因的克隆与非生物胁迫响应分析

利用RT-PCR技术从茶树‘龙井43’cDNA中克隆得到1个编码茶树脱氢抗坏血酸还原酶基因CsDHAR，该基因全长639 bp，编码212个氨基酸，属于谷胱甘肽转移酶（GST）超级家族成员，具较高保守性。系统进化分析结果表明CsDHAR蛋白与拟南芥DHAR1、DHAR2进化关系近，在不同物种间，与毛果杨、胡杨等植物亲缘关系较近；理化性质分析表明CsDHAR属于亲水性蛋白；结构分析表明CsDHAR蛋白具典型功能结构域，三级结构主要由α–螺旋和不规则卷曲构成。荧光定量PCR分析显示，CsDHAR在茶树叶片不同发育阶段表达量差异不显著；对‘龙井43’与‘安吉白茶’中CsDHAR进行荧光定量PCR分析，‘龙井43’在低温、高温处理4 h表达量最高、干旱和高盐处理24 h表达量最高；‘安吉白茶’在高温、高盐处理4 h表达量最高，干旱处理2 h表达量最高。不同逆境胁迫下CsDHAR均被诱导表达，表明该基因参与茶树响应逆境胁迫调节过程。     

茶树CsMAPK3的全长克隆及其逆境表达分析

以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆了CsMAPK3的全长cDNA序列(GenBank登录号:MF034662)、基因组序列及其启动子序列。CsMAPK3的cDNA序列全长1700 bp,含有1119 bp的ORF序列,编码373个氨基酸;CsMAPK3蛋白预测为亲水性蛋白,含有多个磷酸化位点;多序列比对和进化树分析表明CsMAPK3 C–末端含有保守的CD结构域,属于TEY类型的A亚家族MAPK;亚细胞定位预测CsMAPK3主要定位于细胞质和细胞核中。CsMAPK3基因组全长4930 bp,包含5个内含子和6个外显子,第1个内含子和第2个内含子较大,分别为1608和1318 bp,外显子长度在130~350 bp之间。克隆获得起始密码子上游1125 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。荧光定量表达分析显示,ABA、低温和盐胁迫均能显著上调茶树叶片中CsMAPK3的表达。蛋白互作预测表明CsMAPK3可能与MYBR1互作来响应ABA依赖途径的非生物胁迫过程。综上表明,CsMAPK3可能与茶树抗逆响应密切相关。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

龙眼14-3-3基因的克隆与原核表达

 以龙眼(Dimocarpus longan Lour. ) 为试材, 应用同源克隆和RACE方法从花芽中获得了调控 蛋白14-3-3的全长cDNA序列, GenBank登录号为FJ479618 (GI: 218202931) 。该cDNA全长1 121 bp, 包括一个783 bp的开放阅读框, 编码261个氨基酸, 序列比较分析显示14-3-3 cDNA具有较高的保守性。半定量RT-PCR分析结果表明, 14-3-3 mRNA在龙眼叶芽、叶片、花芽和成熟的花中都有表达, 但在花芽中表达量最大。构建了pET14-3-3原核表达系统, 将14-3-3全长cDNA在大肠杆菌中表达, 获得一个分子量约为34 kD的可溶性融合蛋白, 经Western blotting验证, 该蛋白为14-3-3蛋白。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

黄瓜果实弯曲相关基因Cs14-3-3 的克隆及表达分析

 以黄瓜（Cucumis sativus L.）果实易发生弯曲的品种‘长春密刺’为试验材料,采用RT-PCR 技术从果皮中分离并克隆了14-3-3 蛋白基因,并将此基因命名为Cs14-3-3。Cs14-3-3 基因cDNA 全 长792 bp,编码263 个氨基酸,分子量29 589.287 Da,等电点为4.585。生物信息学分析表明此基因含有 14-3-3 蛋白基因的典型结构域,与其他物种14-3-3 蛋白基因核苷酸序列同源性达到75%以上,编码的氨 基酸序列同源性达到85%以上,属于14-3-3 蛋白基因家族。同时,采用实时荧光定量PCR 方法对顺直果 实和弯曲果实腹部及脊部在果实开花的2、4、6、8、10、12 d 的基因表达量进行了研究。结果显示,在 果实发育各个时期,Cs14-3-3 的表达量均为在弯曲果实腹部 > 顺直果实 > 弯曲果实脊部的表达量;在 各个部位,Cs14-3-3 在果实开花2 d 的表达量明显高于开花后其他时期。试验结果表明,Cs14-3-3 基因为 黄瓜果实弯曲相关基因,在黄瓜果实开花早期发育过程中起重要作用。