牡丹SERK2基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析

根据牡丹休眠相关的差减文库中筛选得到的类体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因SERK2的部分cDNA片段,采用RACE技术扩增到5′和3′ cDNA片段,通过拼接得到PsSERK2基因2 374 bp的全长cDNA序列,其中5′非编码区（UTR）为158 bp,3′UTR为341 bp,ORF为1 875 bp,编码625个氨基酸。同源性分析得出其与葡萄VvSERK2蛋白同源性最高,为92.95%。PsSERK2在初花期（大风铃期）茎中表达量最高,叶片中最低。Northern杂交和定量PCR结果均表明PsSERK2在低温解除牡丹花芽休眠前期上调表达,而后降低。低温累积过程中,花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加。推测PsSERK2上调表达促进了休眠花芽的发育,进而促进内休眠的解除。     

冬枣两个ACC氧化酶基因的cDNA克隆及其表达模式

 根据植物ACC氧化酶（ACO）家族的氨基酸和核苷酸保守区序列设计简并引物,采用3′RACE技术从半红期冬枣果实中分离了两个ACO同源基因片段,随后通过PCR技术进一步获得了两个包含完整开放阅读框（ORF）及3′端非编码区（UTR）序列的ACO基因的cDNA,即ZjACO1和ZjACO2。两个基因序列在GenBank中的登录号为EU216549和EU216550,其大小分别为1 115 bp和1 105 bp,编码蛋白大小分别为319个和321个氨基酸。ZjACO1和ZjACO2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为79.4%和84.0%。Northern杂交结果表明,这两个基因在冬枣叶片中不表达,而在不同发育阶段果实中的表达具有明显差异。     

果实CCoAOMT与LAR基因的筛选与表达分析

以果实为研究材料,探讨了PsCCoAOMT和PsLAR基因在果实不同发育时期的表达动态,采用两步法逆转录与抑制PCR技术相结合的方法构建含果实不同发育时期的均一化全长cDNA文库,通过稀释池PCR法筛选出酚类物质代谢途径中的关键酶基因PsCCoAOMT和PsLAR。结果表明:PsCCoAOMT和PsLAR全长cDNA序列分别为1 195bp和1 625bp,对应的ORF分别为744bp和1 050bp,分别编码247和349个氨基酸。PsCCoAOMT相对分子量为27 893.8,等电点为5.42,属于亲水性稳定蛋白;PsLAR相对分子量为38 483.1,等电点为5.40,具有亲水性,属于不稳定蛋白。同源性分析表明,PsCCoAOMT氨基酸序列与白梨相似性达96%,PsLAR氨基酸序列与蔷薇科植物高度同源。荧光定量结果表明,PsCCoAOMT在整个生长发育过程表达量差异都不明显,整体呈下降趋势,花后50d表达量最低;PsLAR在整个生长发育过程表达量呈明显的下降趋势,前期高后期低,花后125d表达量最低。     

马铃薯GLDH基因的克隆及序列分析

 以马铃薯品种‘Favorita’叶片中的cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3′RACE和5′RACE技术,获得了L–半乳糖酸–1,4–内酯脱氢酶（EC 1131213,GLDH）基因cDNA 2 563 bp的全长序列,命名为StGLDH（GenBank：FJ755844）。序列分析表明,该基因编码区长1 773 bp,编码590个氨基酸,与其他植物GLDH氨基酸序列具有很高的同源性,尤其与番茄、辣椒、烟草GLDH 氨基酸序列具有90.6% ~ 95.9%的同源性。荧光定量分析表明,该基因在马铃薯不同器官中均有表达,在幼叶和功能叶中表达量最高,在茎中表达量最低;除匍匐茎外,其它器官中抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）含量与StGLDH的表达高度一致。     

(木奈)果实CCoAOMT与LAR基因的筛选与表达分析

以(木奈)果实为研究材料,探讨了(木奈)PsCCoAOMT和PsLAR基因在(木奈)果实不同发育时期的表达动态,采用两步法逆转录与抑制PCR技术相结合的方法构建含(木奈)果实不同发育时期的均一化全长cDNA文库,通过稀释池PCR法筛选出酚类物质代谢途径中的关键酶基因PsC-CoAOMT和PsLAR.结果表明:PsCCoAOMT和PsLAR全长cDNA序列分别为1 195 bp和1 625 bp,对应的ORF分别为744 bp和1 050 bp,分别编码247和349个氨基酸.PsCCoAOMT相对分子量为27 893.8,等电点为5.42,属于亲水性稳定蛋白;PsLAR相对分子量为38 483.1,等电点为5.40,具有亲水性,属于不稳定蛋白.同源性分析表明,PsCCoAOMT氨基酸序列与白梨相似性达96％,PsLAR氨基酸序列与蔷薇科植物高度同源.荧光定量结果表明,PsCCoAOMT在(木奈)整个生长发育过程表达量差异都不明显,整体呈下降趋势,花后50 d表达量最低;PsLAR在(木奈)整个生长发育过程表达量呈明显的下降趋势,前期高后期低,花后125 d表达量最低.     

(木奈)肉桂酸-4-羟化酶基因及其启动子克隆与表达分析

以不同发育时期的果实为试材,采用两步法逆转录与抑制PCR技术相结合的方法构建均一化全长cDNA文库,筛选出一条编码肉桂酸-4-羟化酶的全长cDNA(命名为PsC4 H);采用APA-Walking技术,分离获得该基因的启动子序列;采用实时荧光定量PCR技术,检测该基因在果实不同发育时期的表达动态。结果表明:PsC4 H基因全长为1 772bp,ORF(Open Reading Frame)为1 515bp,编码504个氨基酸,相对分子量为145 719.6,等电点为4.94,经序列同源性分析发现,PsC4 H氨基酸序列与李属果树高度同源;经PlantCare软件预测,PsC4 H基因的启动子除具有TATA/CAAT-box外,还含有G-box、HSE等特异作用元件;实时荧光定量结果显示,PsC4 H在果实整个生长发育过程中呈下调-上调的表达趋势,其中在成熟果中表达量最高。     

狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析

利用RACE 技术从狗蔷薇（Rosa canina）类根体中克隆得到1 个细胞分裂素氧化酶基因cDNA全长,命名为RcCKX5。序列分析表明,RcCKX5 cDNA 全长1 815 bp,5′ UTR 104 bp,ORF 1 626 bp,3′ UTR85 bp,编码541 个氨基酸,具有CKX 家族典型的FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合域和CK（细胞分裂素）结合域。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示RcCKX5 与可可TcCKX5 亲缘关系最近,与拟南芥AtCKX5、乌拉尔图小麦TuCKX5 同源性较高。荧光定量PCR 分析表明,狗蔷薇RcCKX5 在其根、茎、叶、花、果实中均有表达,根中相对表达量最高,花和果实中相对表达量较高。在狗蔷薇类根体形成发育过程中RcCKX5 的相对表达量不断升高,21 d 时达到最高,随后稍有下降,表明其可能参与了类根体的形成。6-BA 处理结果表明RcCKX5 能够快速响应6-BA 的诱导,表达量显著上调,2.5 mg · L-1 6-BA处理120 h 时,RcCKX5 的相对表达量达到最高峰。     

冬枣两个乙烯受体编码基因的克隆及序列分析

 根据植物乙烯受体ETR1家族氨基酸和核苷酸的保守区序列设计简并引物, 通过RT2PCR从半红期冬枣果实中分离了两个1 058 bp的乙烯受体cDNA片段。在分析已知序列基础上, 分别通过3′RACE及对两个基因上游5′端编码区的扩增, 得到了两个包含完整开放阅读框(ORF) 以及3′端非编码区( 3′UTR) 的乙烯受体编码基因, 即ZjETR1和ZjERS1。它们分别编码738个和632个氨基酸。这两个编码基因的氨基酸与其它植物乙烯受体氨基酸高度同源, 分别属于ETR1亚类和ERS1亚类乙烯受体。     

菜薹蛋白精氨酸甲基转移酶基因BrcuPRMT5的克隆及表达分析

以‘油青49’和‘油青甜菜薹80’菜薹茎尖为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得组蛋白甲基转移酶基因Brcu PRMT5的全长cDNA和gDNA序列。BrcuPRMT5 cDNA序列全长为2 117 bp,其中完整开放阅读框为1 929 bp,编码642个氨基酸,相对分子量为71.55 kD,理论等电点(p I)为5.87;多序列比对结果表明,Brcu PRMT5编码的氨基酸序列含有高等植物PRMT5基因1个高度保守的结构域;系统发育分析结果显示与大白菜、油菜及甘蓝的亲缘关系最近;亚细胞定位软件分析得知,Brcu PRMT5蛋白无跨膜区域,可能定位于线粒体中;对应的gDNA全长为4 151 bp,含有23个外显子和22个内含子,最长的外显子长度为140 bp,内含子的长度范围为50~150 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析基因的表达,BrcuPRMT5在菜薹不同组织中均有表达,其中在花中表达量最高,叶次之,根中最低;BrcuPRMT5从苗期至完全抽薹开花期的表达量呈现上升趋势。BrcuPRMT5在菜薹花发育过程中可能起一定的调控作用。     

三倍体枇杷花期调控基因Ej SPL5的克隆、亚细胞定位及表达分析

利用同源克隆和c DNA末端快速扩增(RACE)技术从三倍体枇杷‘Q27’中分离得到1个调控花期的SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL)转录因子家族基因EjSPL5。该基因cDNA序列全长为778 bp,其中5′非翻译区(UTR)序列为24 bp,3′UTR序列为214 bp,包含1个长为549bp的开放阅读框(ORF),编码182个氨基酸。蛋白序列比对分析表明,EjSPL5和苹果、拟南芥及金鱼草的SPL蛋白序列具有较高的相似性,均具有保守的SBP结构域和核定位信号(NLS)。分子系统进化分析表明,EjSPL5与苹果MdSPL5具有较高的同源性,聚为同一分支。EjSPL5的亚细胞定位发现,其行使功能区域定位在细胞核。实时荧光定量PCR分析表明,EjSPL5在枇杷萼片和幼果中的表达量较高;二倍体和三倍体枇杷的早、晚花品种中EjSPL5表达量存在显著差异,其表达主要集中在花发育的前6个时期,在花蕾露白期和盛花期的表达量较低。三倍体枇杷EjSPL5表达量在花芽形态分化期最高,二倍体枇杷在花序侧生支轴快速伸长期的表达量最高。早花枇杷品种的EjSPL5相对表达量高于晚花品种。     

牡丹查耳酮合酶基因Ps-CHS1的克隆及其组织特异性表达

以牡丹（Paeonia suffruticosa）品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）基因cDNA全长,命名为Ps-CHS1,GenBank登录号为GQ483511。序列分析结果表明,Ps-CHS1全长1 475 bp,包含82 bp的5′非编码区、208 bp的3′非编码区和一个长度为1 185 bp编码394个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。序列比对和系统进化分析表明,Ps-CHS1与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的CHS亲缘关系较近,相似性达90%以上。相对荧光定量PCR分析表明,Ps-CHS1在花瓣中的表达量最高,其次是萼片,再次是叶片和雄蕊,在心皮中表达量最低。     

莲藕可溶性淀粉合成酶基因LrSSS的克隆与表达特性分析

以莲藕品种‘美人红’叶片为试材,利用RACE结合RT-PCR技术克隆得到全长4 080 bp的莲藕可溶性淀粉合成酶基因（LrSSS）cDNA序列（GenBank登录号：KP201636）,其中开放阅读框3 696 bp,编码1 231个氨基酸;该序列与甜瓜、葡萄SSS基因编码氨基酸序列同源性较高,分别达79%、69%。LrSSS 所编码的氨基酸序列包含3个典型的碳水化合物结合结构域（CBM_25）和1个淀粉合成酶催化域（Glyco_transf_5）。LrSSS 表达分析表明,莲藕根状茎膨大具3节段时,在终止叶叶片中的表达量最高,其次为后把叶叶片,终止叶叶柄表达量最少;在根状茎膨大至4节段时,LrSSS在第1、2节段根状茎中表达量较高,在第3、4节段根状茎中表达量较低,表明在第1、2节段根状茎形态基本建成后LrSSS在调控产物转化为淀粉过程中可能起到重要作用。     

基于EST数据库的葡萄APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

APETALA2(AP2)是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2基因cDNA序列作为模板,对葡萄EST数据库进行同源检索筛选,电子克隆出葡萄AP2基因(Vv-AP2)cDNA序列。以香悦葡萄花cDNA为模板,根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA序列设计特异引物,分别利用RACE技术和特异PCR技术获得该基因3’末端和5’末端,序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA全长。该cDNA的全长为2 208 bp,命名为Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1 536 bp完整的开放读码框(ORF),其5’与3’末端非翻译区分别为268 bp和376 bp。其中,3’末端含有28 bp的Ploy+(A)。该基因在GenBank基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA共编码了511个氨基酸,具备完全保守的核定位信号序列(KKSR)以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中,Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。     

八棱海棠肌动蛋白基因(MrACT)的克隆及分析

以八棱海棠(Malus micromalus Makino)为材料,抽取RNA,反转录成cDNA。采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法,5’-RACE获得长度1121bp的片段、3’-RACE获得883bp的片段,再通过设计引物扩增得到八棱海棠中一种肌动蛋白基因的cDNA的全长序列。该序列全长1134bp,推测其编码377个氨基酸,等电点为5.16,其编码的氨基酸与拟南芥(Arabidopsis thaliana)actin7编码的氨基酸只有2个氨基酸差别。通过对八棱海棠MrACT基因的表达分析,发现在不同组织中,该基因的表达水平没有明显差异,本文为进一步利用RT-PCR技术,以MrACT基因为内标,研究八棱海棠其他基因的丰度打好基础。     

低温胁迫下龙眼碳酸酐酶基因（CA）的克隆与表达分析

 应用蛋白质组学研究低温胁迫下龙眼叶片蛋白质组变化时发现碳酸酐酶（CA）蛋白下调表达。利用RT-PCR方法克隆CA基因的全长cDNA,GenBank登录号JN033201,长度为1 119 bp,包括1个966 bp的开放阅读框,编码321 bp的氨基酸序列,同源性分析表明,12个不同植物同源性为81% ~ 88%。龙眼CA基因具有典型的CA结构域,并且非常保守。实时荧光定量分析结果表明,CA在龙眼根、茎、叶中都有表达,为组成型表达,在叶中的表达量最高,茎和根中的表达量最少。CA基因在低温胁迫下随着低温胁迫时间的延长而发生变化。将CA在大肠杆菌中表达,获得1个约40.5 kD的外源蛋白。推测CA表达与低温胁迫有关。     

百子莲开花相关基因ApFT的克隆及表达分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法得到了百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）FT基因cDNA全长序列,命名为ApFT,GenBank登录号为KC951108。序列分析表明,百子莲ApFT基因cDNA全长815 bp,其中开放阅读框534 bp,编码177个氨基酸,5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR）分别为89 bp和192 bp。ApFT编码的蛋白有一个单一而非常保守的PEBP（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP磷酸乙醇胺结合蛋白）结构域,与玉米（MFT2）、拟南芥（AtFT）和温州蜜柑（CuMFT1）等植物的FT蛋白有较高的相似性,同源性均在50%以上。系统进化树分析表明,百子莲ApFT与玉米（MFT2）聚类关系最近。实时荧光定量qRT-PCR结果显示,整个花芽分化过程中ApFT在叶片中表达量高,茎尖中表达量低。随着花芽分化的进程,在叶片中ApFT表达量逐渐降低,而茎尖中ApFT的表达量在诱导期均高于营养期和花芽分化期,推测该基因可能在调节百子莲花芽分化过程中发挥重要作用。     

‘黄冠’梨类甜蛋白编码基因PbPR5的克隆及其表达特性分析

【目的】分离和克隆类甜蛋白基因Pb PR5,了解其在‘黄冠’梨不同组织、不同发育阶段以及受到非生物胁迫和植物生长调节剂处理时的表达情况。【方法】以‘黄冠’梨(Pyrus bretschneideri‘Huangguan’)组培苗为试验材料,从水杨酸(salicylic acid,SA)处理的c DNA文库中克隆获得该基因全编码区序列,命名为Pb PR5,对其进行生物信息学分析,并研究该基因在盐、聚乙二醇(EG6000)、SA和乙烯(ETH)处理后的表达情况;以12 a生‘黄冠’梨的叶片和果实为材料,探究该基因在叶片和果实不同发育阶段的表达模式。【结果】Pb PR5的c DNA序列长度为741 bp,编码224个氨基酸残基;该基因的基因组DNA序列长度为813 bp,包含1个内含子。生物信息学分析表明,Pb PR5蛋白与其他植物PR5基因编码的氨基酸序列相似性较高。实时荧光定量PCR分析表明:Pb PR5基因在‘黄冠’梨组培苗的根,茎,叶中均能表达,其中根部的表达量高于茎和叶;盐和干旱胁迫诱导了该基因表达,根和茎中的表达高峰均出现在处理后6 h,叶在盐胁迫后24 h和干旱后12 h出现表达高峰;SA和乙烯也诱导了该基因在叶片中的表达。在不同发育阶段的叶片中,老叶表达量最高,成熟叶次之,幼叶中不表达;在不同发育阶段的果实中,成熟果实中表达量最高,幼果期和膨大期果实表达量较低。【结论】Pb PR5基因在‘黄冠’梨各组织中非组成型表达,并且在‘黄冠’梨抵御生物和非生物胁迫过程中可能具有重要的生物学功能。     

蝴蝶兰"大辣椒"APETALA1基因的克隆及表达

以蝴蝶兰"大辣椒"为试材,采用RACE技术克隆蝴蝶兰APETALA1(AP1)基因的cDNA全长,分析基本生物学信息,并初步探索其在花芽分化过程中的作用.结果表明:AP1基因的cDNA全长为1 155 bp,开放阅读框(open reading frame)752 bp,编码250个氨基酸,含有MADS盒与K盒等保守功能结构域.同源性比对结果显示,蝴蝶兰"大辣椒"与朵丽蝶兰、金蝶兰、文心兰、石斛兰和马兜铃等植物的MADS蛋白有较高的相似性,同源性均在80％以上;系统进化树分析显示,蝴蝶兰"大辣椒"AP1基因与朵丽蝶兰聚类关系最近;实时荧光定量PCR检测发现,AP1基因在叶片、根和花葶中均有表达,但表达量有差异.同一器官不同发育时期比较显示,叶片的AP1基因表达量没有明显的时空差异;根AP1基因的表达量随着花芽分化的进程呈递减趋势,其中始花期的表达量最低,盛花期最高;而花葶中AP1基因表达量随着花芽分化呈增加趋势,在盛花期表达量达到峰值.同一时期不同器官比较,花葶中AP1的表达量显著高于同一时期的叶片和根(P＜0.05).由此,推测AP1基因在调控蝴蝶兰花芽分化过程中发挥重要作用.     

白菜S位点糖蛋白基因的克隆与表达分析

 以白菜自交不亲和系为材料，采用RT-PCR技术，用特异引物对SLG基因进行克隆，获得SLG基因cDNA序列长度为1 324 bp，命名为BcSLG。序列分析表明：所获得的白菜BcSLG基因cDNA序列包含一完整的编码框，编码432个氨基酸，含有12个保守的半胱氨酸残基和7个N-糖基化位点。序列比对和系统进化分析表明：BcSLG与其它植物的SLG基因氨基酸序列具有较高的同源性，与大白菜和甘蓝亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明：BcSLG基因在自交不亲和系的柱头中表达量最高，其次是花蕾，叶片中表达最低， 在自交亲和系的柱头、花蕾和叶片中相对表达较低。     

百合肌动蛋白基因lilyActin 的克隆与表达分析

 为了在百合功能基因表达研究中选择一个理想内参基因,依据岷江百合cDNA 文库所获得的百合肌动蛋白（Actin）基因的EST 序列,采用RACE 技术进行该基因cDNA 全长克隆,并利用实时荧光定量PCR 分析其在不同组织中的表达模式,获得百合肌动蛋白基因cDNA 全长序列（GenBank 登录号：JX826390）,命名为lilyActin。该基因cDNA 全长1 367 bp,其中,5′非编码区91 bp,3′非编码区233 bp,开放读码框1 134 bp,编码377 个氨基酸。序列比对发现,该基因与其它15 种植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性达98%。进化分析显示,百合肌动蛋白与郁金香肌动蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 结果显示,该基因在百合的花蕾、叶片和鳞片组织中恒定表达,表明相对于其他物种的内参基因,lilyActin 更适宜作为百合属植物的内参基因。