猪白细胞干扰素的制备及对口蹄疫病毒的抑制试验

以无菌方法采取猪的全血,加入20％F系鸡新城疫弱毒(NDV—F),经18～20h诱导,产生猪白细胞干扰素。以水泡性口炎病毒(VSV)为攻击病毒,用猪肾传代细胞(IBRS)测定猪白细胞干扰素效价,均在12800国际单位以上。同时进行了猪白细胞干扰素对口蹄疫病毒(FMDV)的抑制试验,结果证明有明显的干扰作用。     

猪α干扰素在杆状病毒中表达及其对PRRSV的抑制作用

猪α干扰素具有抗病毒作用,临床上具有广阔的应用前景.为获得重组猪α干扰素,本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪α干扰素基因插入供体质粒pFastBac~(TM) Ⅰ多克隆位点,置于pH启动子控制下,在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化.将重组转移栽体质粒转化DH10感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒.重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blotting证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得表达.镍亲和层析柱纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳相对分子质量为19 000.通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制猪水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测其抗病毒活性为9.67×10~4 U/mL.昆虫培养上清及细胞裂解液经2~8稀释在Mare-145细胞上能够抑制猪蓝耳病病毒增殖.从而为进一步作为抗病毒药物应用于猪疫病的防治研究奠定了基础.     

猪β干扰素的基因改造及真核表达

本试验选择高表达密码子重新设计合成猪β干扰素成熟肽核苷酸,通过设计特异的引物,在毕赤酵母表达系统中表达PoIFN-β,获得分泌表达的高活性重组PoIFN-β,并采用非洲绿猴肾细胞(Vero)-水泡性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法测定重组猪β干扰素的效价,为指导重组PoIFN-β的临床使用和研究其生物学功能提供基础。     

蜂素信号肽介导猪干扰素-γ在杆状病毒中分泌表达及抗病毒活性检测

应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟的猪干扰素-γ基因插入供体质粒pFastBacTM1polyhedrin启动子控制下的多克隆位点,引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(Honeybee melittin signal peptide)取代猪干扰素-γ原有信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组蛋白通过SDS-PAGE、间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性是1.38×106U/mL。     

猪子宫上皮细胞的转染试验

为了研究猪子宫上皮细胞在体内及体外合成和分泌荷尔蒙的情况,特用 SV_(40)DNA转染(Transfection)猪的子宫上皮细胞,1 实验材料1.1 健康成年母猪子宫。1.2 无钙、镁离子 Hank's液(即 IHBSS)1.3 RPMI 1640培养液。1.4 2-MEM 培养液。1.5 胰酶(美国 Sigma 化学公司)1.6 胶原酶(Collagenase,美国 Sigma 化学公司)。     

从江香猪源Ⅰ、Ⅱ型干扰素生菜中融合表达及其生物活性

干扰素(interfern,IFN)是在特定的诱生剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,具有广谱抗病毒活性。从江香猪源Ι型干扰素α2和Ⅱ型干扰素γ于生菜中融合表达及生物活性研究未见报道。本研究应用生菜植物表达系统,将从江香猪源干扰素植物表达载体PBI121-IFNα2、PBI121-IFNα2γ、PBI121-IFNγ、PBI121-Vec转入根癌农杆菌LBA4404中,用真空渗透法将携带干扰素质粒的根癌农杆菌感染生菜叶片;用β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)染色和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-PCR)技术分析从江香猪源干扰素蛋白活性。结果显示:GUS染色和ELISA检测证明从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中实现了表达;Q-PCR检测显示:在Marc-145细胞上从江香猪源干扰素蛋白对PRRSV的复制有明显抑制作用,在PK15细胞上从江香猪源干扰素蛋白对干扰素γ诱导蛋白30(interferon-gamma-inducible protein 30,IFI30)、2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′oligoadenylate synthetase,OAS)、抗黏液病毒蛋白(myxovirus resistance,MX)基因的mRNA水平的上调有一定的促进作用。本研究成功实现从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中进行表达且表达蛋白具有生物学活性,为从江香猪源Ι型和Ⅱ型干扰素新复合型药物植物蛋白的开发利用提供参考依据。     

猪流行性腹泻病毒的分离及适应传代细胞培养病毒株的建立

作者从广东地区表现有流行性腹泻症状的病猪采集的病料通过在细胞维持液中加入每ｍｌ含６０μｇ胰酶量的细胞培养方法，可使Ｖｅｒｏ传代细胞在培养２４小时，６０％细胞出现细胞融合，形成合胞体等特征的细胞病变，并且，经过动物回归试验，电子显微镜观察，血清学，病毒核酸型鉴定和理化特性等试验结果表明，分离获得的病毒分离物为猪流行性腹泻病毒分离获得的ＰＥＤＶ，在含有胰酶的细胞维持液条件下，用Ｖｅｒｏ传代细胞培养传代     

重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性，利用pET-32a载体系统，构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外，MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性，并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性，同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平；之后通过小鼠攻毒保护试验，测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量，ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化，并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示，成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10⁶ IU,对细胞没有损害作用，且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平；在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖，减少促炎因子的产生，延缓临床症状的出现。结果表明，原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性，为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。     

猪白细胞干扰素的理化及生物学特性研究

本试验对猪白细胞干扰素的理化及生物学特性进行了研究，结果表明，猪白细胞干扰毒属α型干扰素，对热、胰酶敏感，对酸不敏感。     

猪圆环病毒病的防制对策

一、历史概述 猪圆环病毒是由Tischer(1974)首次从猪肾传代细胞系PK-15中分离出来,并在1982年证实了该病原来源于当初制备PK-15细胞的猪肾细胞,是一种新发现的病毒,将其命名为圆环病毒(PCV)。该病毒长期持续感染PK-15细胞却不表现细胞病变(CPE),用其人工感染试验猪,均未引起任何临床症状及病理变化,故认为PCV仅是一种能感染猪却不会致其发病的常规病毒。但是,到了1991年Clark报道,在加拿大的猪群中发生一种被称为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的新病,给养猪业造成了巨大的经济损失,之后美国、法国、西班牙、意大利、德国、丹麦、荷兰、北爱尔兰、墨西哥、日本等国纷纷报道了该病的发生。     

牛α干扰素在新城疫病毒La Sota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

研究在已有的新城疫病毒La Sota株反向遗传系统的基础上,利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体,构建表达牛α干扰素(bovine interferon α)完整开放阅读框的全基因组质粒pFL-BoIFN α,转染BHK-21细胞获得表达牛α干扰素重组新城疫病毒.采用RT-PCR方法检测,证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因.将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒,利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(VSV-EGFP)在牛肾细胞(MDBK)上测定rL-BoIFN α抗病毒活性,证实表达牛干扰素的重组新城疫病毒尿囊液能有效抑制VSV-EGFP在牛肾细胞上的复制,rL-BoIFNα接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2× 107 IU/mL.结果表明: 牛α干扰素在重组新城疫病毒rL-BoIFNα接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达,并具有高效而稳定的抗病毒活性.     

猪传染性胃肠炎病毒的分离试验

猪传染性胃肠炎(简称TGE)是由一种病毒引起的猪的急性传染病。1956年Fee和Efo等报导该病毒可在猪肾细胞培养物上传代,1963年Harada首次报导了TGE病毒在猪肾细胞培养物上能出现细胞病变(CPE)(1)。也有报导(2)TGE病毒可在鸡胚、猪肾细胞、猪脾细胞和狗肾细胞培养物内传代增殖。     

猪白细胞干扰素的作用机理及临床应用

农业部《关于进一步加强动物疫病防治工作的紧急通知》传达后,各地密切注视冠状病毒科病毒所引起的动物疫病,对已发现疫病进行早诊断、早预防、早治疗、早控制,经临床验证,猪白细胞干扰素系广谱抗病毒生物药品,对猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻等病毒病治愈率高,疗效显著,值得推广。干扰素的抗病毒作用,是通过干扰素分子与干扰素敏感细胞相互作用,使其形成“抗病毒状态”来实现的。首先是干扰素分子与其敏感细胞表面上的“受体”相结合;由于这种“结合”的相互作用就激活了目标细胞内的“抗病毒蛋白基因”;于是被活化(去抑制)的基因就按“正…     

基因工程猪γ-干扰素对PRRSV和SIV混合感染猪的预防效果试验

应用基因工程猪γ-干扰素和血清对人工感染PRRSV(繁殖与呼吸综合征病毒)和SIV(猪流感病毒)仔猪的预防试验，结果表明猪γ-干扰素预防两种病毒混合感染效果显著，感染前和感染后肌肉注射5万单位猪的发病率分别下降71．2％和60％，猪γ-干扰素和特异性抗体联合使用效果最好，可100％预防病毒感染，表明干扰素和抗体在抗病毒感染方面起到协同作用。本试验不仅为PRRSV和SIV混合感染提供了良好的预防方法，还将对病毒病的预防和治疗起到借鉴作用。     

猪圆环病毒病的流行病学与防控措施

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒引起的一种重要传染病。早在1974年德国学者Tischer等就从猪肾传代细胞系PK-15细胞中分离到该病毒,并于1982年证实为一种单链环状DNA病毒,命名为猪圆环病毒(PCV)。此后,加拿大、法国、美国、英国、日本、印度等国相继报道本病。2000年我国的朗洪武等     

干扰素诱导剂对猪瘟疫苗免疫力的影响试验

鸡新城疫(ND)Ⅰ系苗作为干扰素诱导剂对猪病毒性腹泻的防治作用已有成功的报道.其原理是通过ND-Ⅰ系苗感染猪体后,诱导猪体产生干扰素,从而阻碍了其它病毒在猪体内的增殖,达到防治猪病毒性腹泻的目的.但是,如果ND病毒在猪体内同样干扰猪瘟弱毒苗的增殖,而影响猪瘟疫苗的免疫反应,则它的应用价值不大.为此我们进行了ND-Ⅰ系苗对猪瘟疫苗免疫力影响的试验.     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株在不同细胞增殖特性的研究

对猪传染性胃肠炎病毒TH-98分离株进行了在ST，PKl5及IBRS2三种细胞增殖特性的研究，以及不同培养条件对其繁殖滴度的影响。结果表明，在静置培养每件下，用含15％FBS的生长液进行细胞传代，对ST，PKl5及IBRS2三种细胞生长以及接毒后对CPE判定都起到良好效果。但在旋转条件下培养细胞，用l0％的FBS生长液即可使三种细胞生长良好，用ST细胞增殖病毒的滴度明显高于其他两种细胞。旋转培养条件下增殖病毒始终比静置培养繁殖病毒的滴度高，在维持液中加入胰酶未见有病毒滴度的明显提高。     

猪流行性腹泻病毒的分子生物学特性以及胰酶对其作用机理

猪流行性腹泻病毒(PEDV)在体外分离培养需依赖胰酶,目前胰酶对猪流行性腹泻病毒的作用机理尚未完全清晰,文中从分子生物学方面阐述胰酶对猪流行性腹泻病毒的作用。     

用干扰素防制肉鸡肾型传染性支气管炎

干扰素(IFN)是病毒或其他干扰素诱生剂刺激巨噬细胞、淋巴细胞和体细胞时产生的具有高活性、多种生物学功能的糖蛋白.干扰素进入机体后,可利用三级构象相同特点,迅速夺取病毒的宿主细胞,阻断病毒与宿主细胞的结合,夺取病毒复制所需的酶,破坏病毒复制酶环境;刺激机体产生大量的白细胞和巨噬细胞,吞噬和消灭病毒生成翻译抑制蛋白(TIP),彻底阻断病毒与宿主细胞的结合.     

猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律

为了解猪轮状病毒（PoRV）在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律,本试验利用MARC-145细胞,从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV,并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实,命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后,分别收集病毒液进行定量分析;同时,以SC-R分离株感染MARC-145细胞,在感染后不同时间分别收集感染病毒液,利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析,绘制PoRV生长曲线。结果表明,用含3％胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组;-步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈“s型”曲线增长,感染后0～8h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;8～36h为突破期,病毒RNA含量呈对数增长;感染48h增长速度减缓,维持在较高水平,逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性,3％是本试验最为适用的胰酶浓度;PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。