Wistar大鼠GTH细胞的cAMP对FSHβ mRNA表达的影响

[目的]从分子水平阐述大鼠FSHβmRNA表达的GnRH受体后信号转导机制。[方法]采用细胞体外培养技术结合实时荧光定量PCR技术,检测大鼠GTH细胞中cAMP改变对FSHβmRNA表达的影响。[结果]cAMP含量对大鼠GTH细胞表达的FSHβmRNA的Ct值的影响不显著。FSK和SQ22536能有效改变GTH细胞的cAMP含量,却不能改变PKC活性。FSHβ的表达是受GnRH调控的。[结论]cAMP不是FSHβmRNA表达的GnRH受体后的信号转导途径。     

南方鲇垂体的超微结构

应用透射电镜技术,对产卵前、后性成熟野生雌性南方鲇垂体的超微结构进行研究.结果表明:南方鲇垂体呈背腹型,由神经垂体和腺垂体两部分组成.神经垂体具A1、A2和B型神经分泌纤维以及两种类型的脑垂体细胞.腺垂体观察到了8种类型分泌细胞即:促肾上腺皮质激素(ACTH)细胞、催乳激素(PRL)细胞、生长激素(GH1、GH2)细胞、促性腺激素(GTH)细胞、促甲状腺激素(TSH)细胞、黑色素细胞刺激激素(MSH)细胞和首次在鱼类报道的大型泡状细胞.产卵前、后ACTH细胞超微结构变化明显,参与促进卵母细胞的最后成熟和排卵活动;GTH细胞产卵前、后均存在激素合成和分泌等不同的生理状态,与卵母细胞的发育、成熟和排卵有关;首次在南方鲇观察到了两种超微结构差异明显的GH细胞,具有不同的生理功能,GH1细胞与卵母细胞的成熟及排卵有关,GH2细胞与生长有关.SL细胞由于数量少,未在垂体中间部观察到.     

南方鲇垂体的超微结构

应用透射电镜技术,对产卵前、后性成熟野生雌性南方鲇垂体的超微结构进行研究.结果表明:南方鲇垂体呈背腹型,由神经垂体和腺垂体两部分组成.神经垂体具A1、A2和B型神经分泌纤维以及两种类型的脑垂体细胞.腺垂体观察到了8种类型分泌细胞即:促肾上腺皮质激素(ACTH)细胞、催乳激素(PRL)细胞、生长激素(GH1、GH2)细胞、促性腺激素(GTH)细胞、促甲状腺激素(TSH)细胞、黑色素细胞刺激激素(MSH)细胞和首次在鱼类报道的大型泡状细胞.产卵前、后ACTH细胞超微结构变化明显,参与促进卵母细胞的最后成熟和排卵活动;GTH细胞产卵前、后均存在激素合成和分泌等不同的生理状态,与卵母细胞的发育、成熟和排卵有关;首次在南方鲇观察到了两种超微结构差异明显的GH细胞,具有不同的生理功能,GH1细胞与卵母细胞的成熟及排卵有关,GH2细胞与生长有关.SL细胞由于数量少,未在垂体中间部观察到.     

Nesfatin-1对初情期雌性大鼠促性腺激素及其mRNA表达的影响

为探究侧脑室注射Nesfatin-1对雌性大鼠促性腺激素水平及其mRNA表达的影响,对初情期前雌性大鼠的侧脑室注射Nesfatin-1,采用实时荧光定量PCR法检测促黄体素(Luteinizing hormone,LH)和促卵泡素(Folliclestimulating hormone,FSH)mRNA在垂体中的变化,采用酶联免疫分析法检测血清LH和FSH的浓度。结果表明:在初情期前的雌性大鼠中,Nesfatin-1可促进初情期启动、增加卵巢重量、血清LH水平、垂体LH mRNA和FSH mRNA的表达增加(P0.05);但Nesfatin-1对FSH水平的影响不突出,注射后15min时增加(P0.05),60min不产生影响(P0.05)。侧脑室注射Nesfatin-1后15和60min均能提高血清LH水平,15min时提高更明显(P0.05),但对FSH水平的影响不尽相同。在成年的雌性大鼠中,Nesfatin-1对LH和FSH的分泌不产生影响(P0.05)。Nesfatin-1可通过下丘脑诱导和增强初情期过渡阶段雌性大鼠LH和FSH的释放及LH、FSH mRNA的表达。     

Ghrelin对雌性大鼠促性腺激素分泌及其mRNA表达的影响

【目的】探明Ghrelin在中枢水平上对雌性大鼠促性腺激素分泌及其mRNA表达的影响。【方法】用1 nmol Ghrelin对不同发情周期(发情前期、发情期、发情后期、间情期)雌性大鼠及用不同剂量(0.3,1和3 nmol)Gh-relin对发情后期雌性大鼠分别进行侧脑室注射,15 min后断头采血,离心血清,同时采集脑垂体,采用酶免法测定血清促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH)的质量浓度,用实时荧光定量PCR法检测LH mRNA、FSH mRNA在垂体中的表达。【结果】①在发情前期和间情期,Ghrelin可显著抑制雌性大鼠LH的分泌和LH mRNA的表达(P0.05);Ghre-lin对整个发情周期中FSH的分泌不产生影响,仅在发情期抑制FSH mRNA的表达(P0.05)。②在发情后期,0.3和1 nmol的Ghrelin对大鼠促性腺激素分泌和mRNA表达均无影响,但3 nmol的Ghrelin可显著抑制LH、FSH的分泌和LH mRNA的表达(P0.05)。【结论】Ghrelin在中枢水平上对FSH、LH的释放及FSH mRNA和LH mR-NA的表达均有抑制作用,但存在一定的剂量差异,并受发情周期的调节。     

胰岛素对初情期前母猪垂体细胞促性腺激素释放及生长激素分泌的影响

[目的]探讨胰岛素对猪垂体前叶细胞无血清单层培养细胞分泌促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、生长激素(CH)的影响。[方法]24头140日龄、体重17 kg的母猪被分成高、中、低3个能量组,利用无血清单层培养垂体模型,并用放射免疫法测定细胞液促卵泡素、促黄体素和生长激素浓度。[结果]在不同能量水平上,胰岛素对单层无血清培养垂体细胞FSH、LH及GH释放能力的影响有显著差异(P<0.05),高能组较高,低能组较低。[结论]首次研究了在初情期前母猪体外培养垂体细胞中添加胰岛素对垂体细胞分泌激素的影响,证实代谢激素在初情期前母猪下丘脑-垂体-卵巢水平上调节生殖机能。     

壮阳促孕散对肾阳虚大鼠垂体-性腺轴分泌激素的影响

[目的]研究中药壮阳促孕散对肾阳虚大鼠垂体-性腺轴分泌激素的影响。[方法]用氢化可的松造大鼠肾阳虚模型,造模7 d,造模同时中药治疗组和阳性对照组灌胃给药13 d,放射免疫法测定血清睾酮(T)、促黄体生成激素(LH)和促卵泡生成激素(FSH)。[结果]模型对照组造模后出现明显的阳虚证表现,血清中T下降,LH、FSH升高,给药后阳性对照组、中药治疗组血清中T升高,LH、FSH下降。[结论]中药壮阳促孕散可调节肾阳虚大鼠血清中LHF、SH和T的分泌。     

大剂量亚慢性染镉对雌性大鼠血清性激素水平的影响

通过亚慢性皮下注射CdCl2,研究了镉对雌性大鼠血清性激素（E2、P、FSH、LH）水平及卵巢脏器系数的影响。结果表明：镉对卵巢系数及血清中FSH水平无显著影响（P〉0．05）;高剂量组血清中的E2、P、LH水平比对照组的有显著降低（P〈0．05）;低剂量组血清中的P水平比对照组的极显著降低（P〈0．01）。结论为,镉可能通过损伤卵巢和垂体的分泌功能降低了血清中E2、P、LH的水平,具有生殖内分泌干扰效应。     

哺乳动物促卵泡素氨基酸序列特征及其单克隆抗体的制备与鉴定

为制备哺乳动物促卵泡素(FSH)单克隆抗体,比对了人类、家畜、部分野生动物、鼠类等哺乳动物FSH氨基酸序列,分析其种间同源性,结果发现,多种哺乳动物FSHβ亚基氨基酸序列的同源性高于80%,且线性抗原表位高度保守。从奶牛垂体组织扩增FSHβ亚基CDS片段,构建p ET28aFSH重组质粒,诱导表达FSH重组蛋白,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞孔,取效价最高孔进行克隆和亚克隆,获得1株能够分泌抗FSH的单克隆抗体细胞株,命名为B4A5。B4A5细胞株经过数次传代培养、反复冻融后生长状态良好,且能够稳定分泌抗体。采用细胞株体外培养和小鼠腹水诱生法均制备了抗FSH的单克隆抗体,其效价分别为1∶640、1∶106。分别采用Western blot和间接ELISA法鉴定单克隆抗体的结合特异性和交叉反应性,结果显示,制备的单克隆抗体与FSH反应呈阳性,与促黄体素(LH)、促甲状腺素(TSH)、促乳素(PRL)、人绒毛膜促性腺激素(h CG)均无交叉反应性。综上,获得了1株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体可特异性结合FSH蛋白。     

济宁青山羊发情周期内促性腺激素和性激素分泌规律的研究

本试验对处于繁殖季节的济宁青山羊进行颈静脉采血,用放射免疫分析法测定了血浆内促性腺激素(FSH、LH)和性激素(E2、P)的含量。结果表明:整个发情周期中FSH、LH和E2均先后出现4个分泌峰,FSH的4个分泌峰分别晚于LH峰2 d出现。E2的分泌峰除第3个分泌峰出现在第10天之外,其余3个峰均与LH峰同时出现。P在发情周期的第5天开始逐渐升高,间情期(第7~17天)维持在一个较高的水平(P>0.05),发情前一天(第18天)骤然下降。在发情期和间情期,FSH和LH分泌方式均呈脉冲式,E2和P为波动式分泌。发情期FSH的脉冲频率较间情期低(P>0.05),而LH的脉冲频率则高于间情期(P>0.05)。     

血清浓度对鸡胚盲肠上皮细胞原代培养的影响

为探讨细胞培养基中血清浓度对鸡盲肠上皮细胞体外培养的影响,分别用含0%、2.5%、5%和10%胎牛血清(FBS)的细胞培养液培养鸡胚盲肠上皮细胞,检测细胞活性;选择适宜的FBS浓度,并测定了该浓度条件下鸡盲肠上皮细胞的生长特性。结果表明:用含2.5%和5%FBS的培养基培养鸡胚盲肠上皮细胞,第4天细胞贴壁率达最高,分别为84%和80.33%,显著地高于无血清和10%FBS组(P<0.01/0.05),第7天仍均维持在76%以上,两者间除了第2天外,其余差异均不显著;用含2.5%FBS的细胞培养基进行鸡胚盲肠上皮细胞原代培养,第2~3天为适应阶段,第3~5天处于对数生长期,第5~9天细胞进入减速期,第10~11天再次进入对数生长期,第11天以后细胞进入衰退期,整个过程持续14 d左右。鸡胚盲肠上皮细胞培养的血清浓度以2.5%FBS为宜。     

RNAi对绵羊颗粒细胞体外培养过程VEGF 及其受体mRNA表达的影响

[目的]明确RNA干扰(RNAi)对绵羊颗粒细胞体外培养过程中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体mRNA表达的影响,为开展VEGF在绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中信号通路的相关研究打下基础.[方法]采用电穿孔技术将针对VEGF两个受体Flt-1和KDR/Flk-1的两条有效双链小RNA导入绵羊颗粒细胞内,利用实时荧光定量PCR检测体外培养绵羊颗粒细胞各培养时间VEGF、Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA表达水平的变化.设定筛选出的Flt-1和KDR/Flk-1有效干扰片段分别为试验组Ⅰ和试验组Ⅱ,两个干扰片段共同作用为试验组Ⅲ,无效的干扰片段为对照组.[结果]绵羊颗粒细胞体外培养过程中,VEGF mRNA在各时间段的相对表达量是Flt-1 mRNA相对表达量的102倍、KDR/Flk-1 mRNA相对表达量的103倍;培养第1 d时,试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组ⅢVEGF mRNA相对表达量分别为2.62×10-2、3.54×10-2和2.94×10-2,均极显著高于对照组(P<0.01,下同),3个试验组的VEGF mRNA表达量从第2 d开始降低,直到第6 d与对照组趋于一致.试验组ⅡFlt-1 mRNA相对表达量从培养第1 d的1.02×10-1逐渐降至第7 d的8.99×10-4,且一直极显著高于其他组;试验组Ⅰ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无Flt-1 mRNA表达,随着培养时间的延长逐渐呈上升趋势,第8 d时各组趋于一致.试验组Ⅰ的KDR/Flk-1 mRNA相对表达量从第1 d开始极显著低于对照组;试验组Ⅱ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无KDR/Flk-1 mRNA相对表达,随着培养时间的延长呈上升趋势,第9 d时各组趋于一致.[结论]两个有效干扰片段在绵羊颗粒细胞体外培养过程中起到很好的干扰作用,可改变VEGF、Flt-1及KDR mRNA的表达量,进而影响颗粒细胞相关生长信号的传输.     

胚胎移植时机对牛体细胞克隆胚胎妊娠率的影响

以活体取卵OUP来源的牛卵母细胞为受体胞质,以Holstein奶牛的牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞克隆．并将发育7d的克隆囊胚和体内胚分别及体外胚进行移植,观察移植时机对受孕率的影响。依据代孕牛排卵后天数的不同分为3个实验组,组1：排卵后5-6d（不含6d）;组2：排卵后6—7d;组3：排卵后7～8d（不含7d）。结果显示：对于体外胚胎而言,第2组的受孕率高于第1组（P〉0．05）,第3组的受孕率最低（Pt0．05）,且120d的受孕率为0。与此相反,对于体内胚胎。第3组的受孕率高于其他2组。通过实验可以证明对于7d的体外胚胎选择在代孕牛排卵后6—7d移植可以得到较高的受孕率：而对于体内胚胎而言则应选择在受体牛排卵后7—8d移植,可得到较高的妊娠率。     

仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定

 【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18（ETEC F18）引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1 的CDS区第307位点处的突变（G→A）,建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系（GG、GA和AA）。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上皮细胞分离效率对比表明,后一种消化方式更为有效。进而取出生12 h内未吃初乳的大白仔猪,剖腹剪取其小肠段,使用联酶混合液灌注消化分离得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。电镜和CK18免疫荧光染色结果均显示,小肠黏膜上皮细胞纯度达90%以上。经纯化处理,最后获得了FUT1基因型为GG和GA的两种小肠黏膜上皮细胞。仔猪原代小肠黏膜上皮细胞培养周期显示,7代前细胞生长状况良好,形态为典型的上皮细胞样,单层细胞呈铺路石排列,培养至第9代,细胞出现生长停滞、胞体空泡化等现象。【结论】最终获得了FUT1基因型为GG和GA的仔猪原代小肠黏膜上皮细胞。建立了仔猪小肠黏膜上皮细胞分离及培养方法,为后续的细胞建系工作奠定了良好的基础。     

梅花愈伤组织培养研究初报

该试验以腋芽和胚为外植体,进行了梅花愈伤组织的长期培养及其细胞学的初步观测．结果表明成年母株腋芽外植体启动培养的愈伤率和发芽率在不同品种和不同培养基之间稍有差异,３＃梅花品种和ＭＳ＋ＮＡＡ２．０＋ＢＡ１．０＋ＺＴ２．０ｍｇ·Ｌ－１培养基较高．胚在ＭＳ＋ＧＡ１０．０培养基上发芽率高,并形成正常无根苗．暗培养有利于愈伤组织的生长,光培养有利于愈伤组织的分化．水解酪蛋白（ＣＨ）既有利于愈伤组织的生长、增殖,也延长了愈伤组织的寿命．梅花愈伤组织在第四代达到生长高峰,附加ＣＨ之后在第七代又出现一次生长高峰;一代之内第四周生长最快．多次继代培养的结果还表明,ＭＳ＋ＮＡＡ５．０＋ＫＴ１．０＋ＣＨ１０００有利于梅花愈伤组织的长期培养．细胞学观测的结果表明,多次继代培养的梅花愈伤组织的细胞形状不规则,核物质相对稀少,并且分化出了很多导管．     

颗粒细胞或卵丘细胞提高小鼠未成熟卵母细胞恢复减数分裂能力的研究

本研究通过12～13d小鼠颗粒细胞或21d小鼠卵丘细胞与14d小鼠直径55～65μm的卵母细胞共培养7d,发现单独培养、与颗粒细胞共培养、与卵丘细胞共培养的直径分别为54.2±1.6μm、65.2±2.3μm和63.4±3.4μm。而且,共培养提高了卵母细胞GSH的表达量(p<0.05)。在与颗粒细胞共培养7d后,11.1%(27/254)的卵母细胞能完成第一次减数分裂达到MII期。说明了小鼠颗粒细胞或卵丘细胞能够促进未成熟卵母细胞的发育及减数分裂的恢复,为研究哺育动物卵母细胞的发育调控提供了依据。     

Tumor cell rejection through terminal cell differentiation

Leukemic cells cultured in the presence of various conditioned media differentiate into macrophages. This finding suggested that the maintenance of undifferentiated state and self-renewal in vivo may be related to the inability of the host to generate an appropriate level of differentiation factor (DF). Evidence for this hypothesis was derived from experiments in vitro and in vivo with myeloid leukemia of rat. The following results were obtained: (i) in vitro, the percentage of cell differentiation at a fixed concentration of DF was inversely related to the concentration of cells; (ii) leukemic cell inoculates that were lethal to 7-day-old rats were rejected by 21-day-old rats; (iii) leukemic cells in diffusion chambers underwent differentiation in 21-day-old rats but not in 7-day-old rats; (iv) organs from 21-day-old rats contained more DF activity than those of 7-day-old rats; (v) treatment of rats with DF in diffusion chambers resulted in leukemic cell differentiation inside the chamber; and (vi) the development of leukemia in 7-day-old rats was aborted by treatment with DF. These results show that the differentiation of rat leukemia cells requires the appropriate level of DF. The proliferation of transplanted leukemia cells in 7-day-old rats goes unchecked because of inadequate generation of DF. Conversely, in the 21-day-old rats, rejection is accomplished by differentiation of the transplanted cells.     

水牛胚胎分割技术的研究

为探讨水牛桑椹胚去致密化和不同分割方法对水牛切割胚发育效果的影响,将体外受精获得的水牛桑椹胚（第5d）和囊胚（第6～7d）分割后进行体外培养,观察其发育情况。结果显示：（1）水牛桑椹胚经去致密化处理后,其分割成功率（67．69％vs．51．71％）和囊胚发育率（58．30％vs．41．13％）均显著高于未处理组（P〈0．01）,但囊胚细胞数差异不显著（P〉0．05）;（2）以直接分割法和单臂分割法分别分割桑椹胚和囊胚,其分割成功率、囊胚发育率和囊胚细胞数三者均无显著差异（P〉0．05）。可见,水牛桑椹胚去致密化有利于切割胚的成活和发育,而直接分割法和单臂分割法均可用于水牛桑椹胚和囊胚的分割。     

Metachromatic leukodystrophy (sulfatide lipidoses) cultured in vitro

Cerebral white matter from a patient with metachromatic leukodystrophly was successfully cultured in vitro. A luxuriant growth in Rose chambers and in roller tubes was apparent by the 14th day. The outgrown cells contained large numbers of granules which stained dark brown with cresyl violetacetic acid. The growth and metachromasia were maintained up to 80 days in vitro.     

山羊体细胞重编程过程中慢病毒对细胞的毒性作用

[目的]检测慢病毒对普通山羊、克隆奶山羊和转基因克隆奶山羊的作用.[方法]采用慢病毒作为载体感染普通山羊、克隆奶山羊(♂12001)和转基因克隆奶山羊(♀12003)体细胞,通过细胞生长曲线,检测慢病毒对3种山羊细胞的毒性作用.[结果]感染后的3种体细胞在感染前3 d,细胞大量凋亡,4~7 d筛选出的细胞大量增殖.未经慢病毒感染的3种细胞接种2 d后数量开始明显增加,第25天进入对数生长期,第57天进入平台期,呈现典型的"潜伏期-对数生长期-停滞期"生长模式.[结论]慢病毒对细胞有毒性作用,会引起细胞大量凋亡.