一个新的编码大豆DREB转录因子基因的克隆及鉴定

DREB转录因子是一类可以调控多个与干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达的转录因子家族。从大豆耐盐品种铁丰8号中克隆了一个新的DREB基因GmDREB5。该基因编码309个氨基酸，具有典型的AP2／EREBP保守结构域，属于AP2／EREBP类转录因子中的DREB亚族。同源性比较分析表明，GmDREB5基因与Genbank登录的DREB基因同源性不高，属于新基因。酵母转录激活实验证明，该基因可以与DRE顺武作用元件特异结合，并具有转录激活活性；同时采用CaMV35S启动子驱动，构建了植物表达载体pBl35S-GmDREB5，并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中，再利用叶盘转化法将重组质粒导入烟草品种W38中。获得转基因烟草植株30株。     

烟草谷氧还蛋白基因NbGRX1的克隆与表达特性分析

采用同源克隆及cDNA末端快速扩增法(RACE),从烟草中克隆到1个谷氧还蛋白基因(Grx),命名为NbGRX1.该基因全长1 021 bp,编码298个氨基酸,具有典型的Grx基因结构域.Real-time RT-PCR分析表明,该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,并且受低温、干旱和高盐诱导.     

GmDREB8在大豆干旱胁迫下的功能分析

[目的]本研究旨在解析大豆DREB(dehydration responsive element-binding protein)转录因子基因GmDREB8与干旱胁迫的关系，为DREB转录因子参与大豆干旱胁迫的分子机制研究奠定基础，也为大豆耐旱转基因育种提供新的基因资源。[方法]以大豆品种‘天隆1号’为试材，通过荧光定量PCR(RT-qPCR)分析10个DREB基因在干旱胁迫诱导下的表达模式及GmDREB8在大豆不同组织和植物激素处理下的表达。采用生物信息学方法分析GmDREB8保守基序和亚细胞定位。通过农杆菌介导的烟草瞬时表达体系进行GmDREB8蛋白的亚细胞定位。分别在拟南芥中异源表达GmDREB8和利用VIGS(virus-induced gene silencing)技术在大豆中沉默GmDREB8,分析该基因在拟南芥和大豆干旱胁迫中的功能。[结果]10个DREB基因在干旱胁迫下都被诱导表达，但这10个基因间表达谱存在差异。筛选并克隆得到GmDREB8,其位于大豆17号染色体上，含有1个AP2结构域，蛋白相对分子质量为19.79×10³,pI为9.76。Gm...     

牡丹抗逆转录因子基因PsDREB的功能解析

通过酵母单杂交试验,对牡丹抗逆转录因子基因PsDREB的DNA结合能力及转录激活功能进行分析。结果显示:PsDREB蛋白能够特异性地与顺式作用元件DRE(dehydration responsive element,干旱应答元件)结合,但不能与突变的DRE(mDRE)结合;该蛋白能够激活下游报告基因His的表达,从而使酵母细胞在缺失His的培养基上能够正常生长。说明PsDREB具有转录激活功能。为了进一步研究该转录因子基因PsDREB在植物抗逆反应中的功能,利用农杆菌介导法将其转化到模式植物烟草中,对获得的转基因烟草进行低温、干旱、高盐、脱落酸等胁迫处理。结果发现:与对照相比,超量表达PsDREB基因能够明显提高烟草对逆境胁迫的抗性,尤其是在抗干旱和高盐方面效果显著。     

抗逆相关DREB转录因子的研究进展及应用

DREB转录因子即干旱应答元件结合蛋白,可以特异地与DRE顺式作用元件结合,在非生物逆境胁迫(干旱、低温、高盐)中激活胁迫诱导基因的表达,使植物能够耐受水分胁迫的影响.本文介绍DREB转录因子的结构特点和生物学功能,表达调控以及在抗逆基因工程方面的研究进展,同时对DREB转录因子在信号传递和调控网络方面的复杂性进行了讨论.     

铃铛刺抗逆转录因子基因HhDREB2的克隆及分析

利用同源克隆和RACE(rapid amplification of cDNA end)技术从豆科铃铛刺属灌木铃铛刺中分离了一个DREB类转录因子基因的全长cDNA序列,命名为HhDREB2（Genbank No.:EU872018）。序列分析表明,该基因全长为873 bp,在108~626 bp处为开放阅读框,无内含子,编码172个氨基酸残基,分子质量为19.702 kDa,等电点8.92。系统进化树和同源序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白含有一个典型的AP2/ERF保守结构域,并与大豆GmDREB1和GmDREB2的亲缘关系较近,属于A5亚组。通过酵母单杂交试验,发现HhDREB2基因编码的蛋白具有转录激活的功能。此外,在洋葱表皮细胞中进行该基因的瞬时表达,证实了HhDREB2蛋白定位于细胞核。半定量RT\|PCR检测发现,HhDREB2基因受干旱、高盐和低温的诱导表达,而对GA3、NAA、ABA和6BA的处理无明显的变化。     

烟草NtGRAS基因的克隆与转录激活及表达特性分析

以烟草品种NC89为试验材料,通过电子克隆获得1个烟草GRAS家族基因NtGRAS。该基因编码区长为1 311 bp,编码436个氨基酸。生物信息学分析结果显示,NtGRAS蛋白的相对分子质量为47 781,等电点为5.16,亚细胞定位于细胞核。进化树分析发现,NtGRAS蛋白与拟南芥At SCL23蛋白高度同源。酵母转录激活结果表明,Nt GRAS蛋白具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明,NtGRAS在烟草的根、茎、叶和花中均有表达,其中在根部的表达量最高;低温(4℃)、NaCl(200μmol/L)和干旱均能诱导NtGRAS基因上调表达。     

杨树转录因子PtoMYB057 的功能分析

转录因子在转录水平上调控目的基因的表达是植物对其生长调控的一种重要方式.以杨树为材料,克隆了杨树PtoMYB057转录因子的全长cDNA.荧光定量PCR的分析表明,PtoMYB057在木质部高水平表达.系统进化分析表明,PtoMYB057与拟南芥MYB006、MYB008、MYB003、MYB007、MYB108相似性较高.根据亚细胞定位结果,证实了PtoMYB057定位于细胞核中.在烟草中过量表达PtoMYB057基因的试验表明,此基因对烟草的生长以及茎发育有影响.     

水稻DREB1基因过表达载体的构建与转化

为了研究DREB1的功能,从水稻cDNA中克隆了DREB1基因,成功构建了该基因的高效植物表达载体pCAMBIA-DREB1。采用农杆菌介导法转化水稻,经PCR、Southern blot分析表明,DREB1基因已经成功地整合到水稻基因组中,获得水稻DREB1基因过表达转基因植株。     

盐地碱蓬2个DREB1/CBF基因的克隆与表达调控分析

【目的】从盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）中克隆2个DREB1/CBF,分析其序列特征、编码蛋白的亚细胞定位和转录激活活性,以及在非生物胁迫下的表达模式,为进一步研究盐地碱蓬的抗逆机制提供依据。【方法】利用同源克隆法获得盐地碱蓬2个DREB1/CBF片段,采用RACE技术克隆获得cDNA全长序列,分别命名为SsCBF1和SsCBF2。运用生物信息学软件对2个SsCBF及其编码蛋白进行分析,并将它们分别与GFP融合构建植物表达载体,通过基因枪转化法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达,观察它们编码蛋白的亚细胞定位。利用酵母单杂交系统研究2个SsCBF与DRE/CRT顺式作用元件的结合特异性和转录激活活性。采用Real time-PCR研究2个SsCBF在低温、NaCl、PEG以及ABA处理下的表达模式。【结果】 SsCBF1编码一个225个氨基酸的蛋白,预测分子量为25.4 kD,理论等电点为4.84。SsCBF2编码一个由260个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为28.6 kD,理论等电点为5.05。SsCBF1和SsCBF2均含有1个典型的AP2/ERF保守结构域,在核苷酸和氨基酸水平上分别具有53.5%和45.4%的同源性,而2个基因的AP2/ERF结构域在核苷酸和氨基酸水平上分别具有76.2%和87.3%的相似性。SsCBF1、SsCBF2归属于DREB亚组的A-1组,定位于细胞核内,均能与DRE/CRT顺式作用元件特异性结合,并激活下游报告基因的表达。低温、干旱、高盐和ABA能够诱导SsCBF1表达,而SsCBF2在低温处理下表达量上调,但对干旱、高盐和ABA处理不响应。【结论】SsCBF1和SsCBF2是盐地碱蓬的2个胁迫应答转录因子。在盐地碱蓬中,SsCBF1通过依赖ABA途径参与对高盐、干旱和低温等非生物胁迫的应激调控,而SsCBF2则通过不依赖于ABA途径对低温胁迫产生响应。     

金柑MLP2–2基因抑制蛋白酶活性的功能分析

MLP2–2基因是存在于金柑中的一种H2B蛋白互作基因.对金柑MLP2–2基因进行生物信息学分析,发现MLP2–2蛋白序列中存在跨膜结构域,与Kunitz蛋白酶抑制剂具有同源性;对2年生金柑幼苗进行冷驯化,提取叶片RNA,反转录获得MLP2–2基因的cds序列,转入pBRT7质粒构建pBRT7–MLP2–2过表达载体后...     

大豆杂种后代蛋白质含量的遗传研究：Ⅱ.杂种后代的遗传分析

利用蛋白质含量不同的６个亲本的不完全双列杂交的Ｆ１，Ｆ２代资料，分析了蛋白质含量的遗传变异趋势及与其他性状间的相互关系。结果表明，双亲的蛋白质含量差异大，Ｆ２变异程度也大。蛋白质含量的遗传力较高，可在Ｆ２代选择并能获得一定的遗传进度，Ｆ１，Ｆ２代的蛋白地岑与母本的含量及双亲中亲值呈极显著的正相关。Ｆ２代的蛋白质含量与百粒重呈极显著的正相关，与脂肪含量呈极著的负相关。     

鸡α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究

【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2亚型病毒(AIV H9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。【结果】成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kD,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和IBDV活性明显高于单一rChIFN-α的抗病毒活性;rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。IFN-α活性单位为200IU的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡和胚体出血,并能显著延长鸡胚存活时间,但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。合适剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内具有显著的抗病毒活性和免疫增强活性。【结论】rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性,这为进一步研究以rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。     

小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位

通过RT PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa 的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5′端和3′端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL C2X中构建重组表达载体MBP P2N,MBP P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP P2N和MBP P2C融合蛋白。MBP P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。     

家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)的表达及活性研究

 【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。     

热胁迫对葡萄叶片中蛋白激酶活性的影响

 以葡萄品种京秀（Vitis vinifera L. cv. Jingxiu）一年生扦插苗为试材，40℃高温处理30 min，并以25℃为对照，采用体外底物磷酸化方法对叶片中蛋白激酶的活性进行了测定。结果表明，热胁迫处理后，叶片中蛋白激酶在底物髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)浓度为0.5 mg·ml-1时，其活性达到最大(7 678.7 cpm)，而后随底物浓度的进一步增加，其活性下降。Mg2+浓度为5 mmol·L-1时，蛋白激酶活性达到最大(8 165.8 cpm)。Ca2+对蛋白激酶活性的影响极弱，Mn2+对蛋白激酶活性的激活没有影响。ATP浓度为50 μmol·L-1时，蛋白激酶的活性最大（7 900.9 cpm），比对照高4.7倍。在以组蛋白-Ⅲ（histone-Ⅲ）为底物时，蛋白激酶的活性很微弱，且Mg2+和Ca2+对蛋白激酶有极弱的激活作用。     

球孢白僵菌CDEP2基因原核表达、蛋白纯化及多克隆抗血清制备

类枯草杆菌蛋白酶是昆虫致病真菌重要的毒力因子,利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因.将其与质粒pET28a连接,构建重组原核表达载体pET28-CDEP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测His-CDEP2融合蛋白以包涵体方式大量表达并对其进行纯化.用SDS-PAGE分离纯化的CDEP2蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗血清.Western blotting免疫印迹检测分析表明,该抗血清对CDEP2蛋白有特异性识别能力,可用于对CDEP2蛋白功能的进一步研究.     

酵母双杂交筛选小麦TaMBD2互作蛋白

为探讨小麦甲基结合域蛋白(TaMBD2)在植物生长发育过程中的调控功能,以TaMBD2基因的全长cDNA为模板,构建诱饵载体pGBKT7-TaMBD2,利用酵母双杂交系统从小麦cDNA文库中筛选TaMBD2互作蛋白。结果共筛选到91个菌斑显蓝色的克隆,对其进行菌液PCR检测并测序,然后在NCBI上进行BLAST比对分析,共获得8个可能与TaMBD2互作的蛋白,分别为二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH结构域蛋白、SIAN蛋白、Agenet结构域蛋白、C2H2型锌指蛋白、磷酸激酶和2个假定蛋白,其中最有可能的TaMBD2互作蛋白为NDPK。这些候选蛋白主要参与细胞信号传导、抗逆、能量代谢和蛋白质运输等。其中,检测结果中参与植物抗逆胁迫的蛋白质为主要互作蛋白,所占比例为54.9%;参与蛋白质运输的互作蛋白所占比例为25.3%,其余互作蛋白所占比例较小。因此,推测TaMBD2可能主要参与植物对干旱、低温和高盐等非生物胁迫逆境的响应及调控。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在大肠杆菌细胞周质中的表达

[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。     

鹅源星状病毒ORF2基因原核表达及遗传进化分析

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱导表达的蛋白经镍亲和层析柱纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别。序列分析表明,该毒株与其他鹅源星状病毒参考毒株的核苷酸相似性介于37.8%~99.3%之间,HLJ-1801分离株与已发表的8株鹅源星状病毒毒株位于同一分支,表明其属于一种新型星状病毒成员。利用原核表达系统成功高效地表达了GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在。本试验成功获得了纯化的ORF2重组蛋白和小鼠抗GoAstV多克隆抗体,为进一步研究ORF2蛋白对星状病毒感染的诊断试剂的研发奠定了基础。