狂犬病病毒G蛋白的过表达及对病毒的抑制

【目的】探究G蛋白在狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)复制中的作用,以揭示携带双G基因的重组RABV的Hep-dG与亲代毒株rHep-Flury在神经母细胞瘤(NA)细胞中滴度差异的原因,为RABV致病机制的研究奠定基础。【方法】通过病毒吸附、入侵、荧光定量PCR、Western-blot以及中和抗体阻断等试验,检测G蛋白过表达对IFN-β以及相关因子转录的影响。【结果】Hep-dG感染能显著上调NA细胞中IFN-βmRNA的表达,激活了下游因子STAT1的表达与磷酸化,在较低的感染复数(MOI=0.01)下,Hep-dG感染后24 h即可显著促进IFN-β基因的表达,36 h达到最高水平(P0.001)。该病毒进入细胞后,产生了更多的病毒Leader RNA和RIG-I mRNA,且与IFN-βmRNA的表达高度一致。抗体阻断IFN-β后,Hep-dG在NA细胞中的病毒滴度显著上升(P0.01),约为阻断前的7.9倍,且与亲代毒株rHep-Flury无显著差异。与阴性对照比较,5μg的pH-G质粒转染能刺激IFN-β的转录(P0.05),表明真核表达RABV G蛋白能在一定程度上刺激IFN-β的转录。【结论】本研究初步揭示了G蛋白激活先天性免疫应答的原因和作用。RABV G蛋白的过表达,通过促进病毒Leader RNA的转录,激活了RIG-I介导的IFN-β通路,进而抑制了Hep-dG在NA细胞的繁殖。G蛋白的过表达也对干扰素通路起到一定的作用。     

巴斯德毕赤酵母多拷贝整合表达组装禽流感病毒样颗粒

【目的】构建多拷贝整合表达禽流感病毒样颗粒的重组巴斯德毕赤酵母,为H5N1亚型禽流感基因工程疫苗提供基础。【方法】以巴斯德毕赤酵母GS115株18S rRNA基因(rDNA)部分序列,插入pPIC9K载体上XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ位点间,构建多拷贝整合表达质粒p8K。再以禽流感病毒H5N1毒株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA、M和NA基因,分别插入多拷贝载体p8K,构建表达质粒 p8K-HA/M/NA。表达质粒分别扩增后线性化,按比例混合,电转化GS115感受态细胞。增菌后,经遗传霉素G418抗性平板筛选、PCR鉴定携带HA、M和NA基因序列的多拷贝整合菌株。阳性菌株增菌、诱导表达、高压均质破碎后,Western-blot检测表达产物。【结果】PCR鉴定阳性的重组菌株,其细胞裂解蛋白,免疫印迹试验可检测到与HA、M₁和NA分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80~120 nm 的病毒样颗粒,免疫鸡能产生抗禽流感病毒中和抗体。【结论】重组毕赤酵母能够多拷贝整合、表达、组装禽流感病毒样颗粒。     

M蛋白基因shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究

 【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA（shRNA）的质粒,将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞,观察荧光或进行半定量PCR;或将其转染Marc145细胞,感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50％,使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%～64%,表达的shRNA在PRRSV感染后48 h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10～1/100倍,间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著减少。【结论】shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制,靶向PRRSV基因组M基因不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。     

表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

【目的】以伪狂犬病病毒为载体，构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒，并研究其生物学特性。【方法】将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中，构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒，然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。【结果】利用检测PCV2 ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+，同时用Southern blotting证实外源基因PCV2 ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting结果显示重组病毒中PCV2 ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明，重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当，且重组病毒对小鼠无致病性，免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。【结论】重组伪狂犬病毒构建成功，且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。     

猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP~+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。     

狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析

【目的】探索狂犬病病毒(RABV)强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对象,利用反向遗传技术将其P基因分别替换到弱毒株rRC-HL和r RC-HL(GX01M)株的对应位置,通过间接免疫荧光试验(IFA)及基因测序鉴定拯救的病毒,并测定重组突变体的多步生长曲线、荧光灶面积及N基因表达水平等,同时通过4周龄昆明小鼠攻毒试验验证P基因及P-M基因联合替换后对RABV致病性的影响。【结果】利用反向遗传技术能成功拯救重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M),通过IFA测定病毒荧光灶面积及多步生长曲线发现,r RC-HL(GX01P-M)株在BSR/T7-9细胞上的生长能力及传播能力均较rRC-HL(GX01P)株和rRC-HL(GX01M)株强。在复制与转录水平上,rRC-HL(GX01P)株的N基因相对表达量高于r RC-HL(GX01M)株,但低于rRC-HL(GX01P-M)株。在昆明小鼠攻毒试验中,重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M)攻毒后第4 d昆明小鼠开始出现精神不振、行动迟缓等症状,其致病性无明显差异;昆明小鼠体质量均呈一过性减轻,之后恢复正常并呈上升趋势;攻毒15 d内均未见昆明小鼠死亡,即重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRCHL(GX01P-M)的致病性较弱。【结论】强毒株GX01的P基因与M基因联合替换可提高病毒传播能力,且二者具有协同性,但对弱毒株rRC-HL的毒力无影响。     

狂犬病病毒M蛋白胞内合成和分布初步研究

【目的】狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是一种主要由核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、依赖RNA的RNA聚合酶蛋白(L)5种结构蛋白组成的高度嗜神经性病毒。RABV基因组RNA与N蛋白、P蛋白和L蛋白组成核糖核蛋白复合体(RNP),M蛋白在调控RABV病毒结构蛋白的合成和装配过程中起重要作用。但RABV不同毒株M蛋白胞内合成、分布场所及其是否存在差异尚不清楚。研究不同RABV毒株M蛋白与内质网、高尔基体以及M蛋白与G蛋白、M蛋白与RNP在N_2A和BHK细胞内的共定位,以期确定RABV M蛋白的胞内合成途径和分布场所。【方法】测定RABV不同毒株(CVS-11、SRV-9、PB4)在N_2A或BHK细胞的TCID_(50),以相同的MOI接毒,通过免疫荧光研究M蛋白与内质网、高尔基体的共定位,以及M蛋白与G蛋白、M蛋白与RNP(为N蛋白代表)的共定位。【结果】RABV不同毒株效价存在一定差异。在N_2A和BHK细胞中,不同RABV毒株的M蛋白与内质网、高尔基体均存在共定位;M蛋白与G蛋白、M蛋白与N蛋白也存在共定位,但M蛋白与G蛋白主要共定位于内质网、高尔基体上,而M蛋白与N蛋白主要共定位在胞浆中。【结论】RABV M蛋白在胞内主要通过内质网-高尔基体途径合成加工。研究结果明确了RABV M蛋白胞内合成分布部位,为进一步研究RABV病毒粒子的装配和出芽过程丰富了数据。     

影响A型流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白研究

 【目的】流感病毒样颗粒在病毒学研究和新型疫苗开发方面发挥着巨大作用。本研究旨在建立一种简便的包装病毒样颗粒的方法来阐明影响流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白。【方法】构建同时表达HA、NA和M1 3个蛋白,同时表达HA和NA两个蛋白以及只表达HA蛋白的真核表达质粒,然后转染293 T细胞,检测细胞培养上清血凝效价初步判断是否包装并释放出病毒样颗粒,并采用透射电子显微镜观察病毒样颗粒的形态。【结果】表达HA和NA或表达HA、NA和M1蛋白的真核表达质粒转染293 T细胞后,检测细胞上清血凝价均为24 ;而转染单独表达HA蛋白质粒的细胞上清没有血凝活性。电镜观察表明单独表达HA蛋白没有可见的病毒样颗粒,而表达上述两个或3个蛋白均可观察到病毒样颗粒。【结论】本研究采用同时表达多个结构蛋白的真核表达载体来研究病毒样颗粒包装及释放的必须蛋白,研究结果表明M1在病毒样颗粒包装及释放过程中是非必须蛋白,而NA和HA蛋白是影响流感病毒样颗粒形成及释放的关键蛋白。     

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

【目的】探明马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。【方法】以PVYN的CP基因cDNA 3′端202 bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。【结果】攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病，而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型，Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组，Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。【结论】抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

湖南洞庭湖区12株H9N2亚型AIV全基因序列的进化分析

【目的】从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律。【方法】对近年来洞庭湖区分离的12株H9N2亚型禽流感毒株的全基因进行分段克隆测序,应用Mega 5软件包对病毒基因进行多序列比对和进化树的绘制与分析。【结果】12株H9N2亚型禽流感毒株HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒。12株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因进化比较同步,均处于DK/HK/Y280/97分支,而6个内部基因(M、PB2、PB1、PA、NA、NS)与高致病性禽流感H5亚型毒株呈现不同程度重组现象,且与H7N9亚型毒株基因的核苷酸同源性很高,很有可能为其提供内部基因。【结论】湖南省洞庭湖地区H9亚型禽流感病毒的遗传演化较为复杂,存在广泛的基因重组现象。     

RNA病毒诱导的烟草WRKY转录因子基因的应急表达

植物和病毒在基因水平上的互作是植物感病和抗病的分子基础。以模式植物烟草及其3种RNA病毒（马铃薯Y型病毒,Potato virus Y,PVY;烟草花叶病毒,Tobacco mosaic virus,TMV;黄瓜花叶病,Cucumber mosaic virus,CMV）为试材,旨在研究受病毒共同诱导、并可能在植物抗病反应中具有重要功能的转录因子基因。试验首先获得10个受病毒诱导的烟草同源基因。在比较了3种病毒侵染、低温和盐害协迫以及逆境信号物质(茉莉酸甲酯与水杨酸)处理对上述基因表达的影响后发现, 3种RNA病毒所诱导的植物基因有所不同。但属于WRKY基因家族的06G基因受3种病毒的共同、高效诱导,其表达水平与叶片发育程度呈负相关。研究结果表明, 该基因在植物病毒病发生及植物抗病分子育种中可能有重要意义。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株JXA1反向遗传平台的构建

【目的】为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。【方法】运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上,并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入Fse I酶切位点,作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救,并对拯救的病毒进行生物学特性分析。【结果】构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性;成功拯救了病毒,命名为rJXA1;成功引入了拯救病毒的遗传标记;拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似,二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。【结论】成功构建了JXA1株反向遗传平台,为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。     

果树病毒载体研究进展

植物病毒载体作为重要的研究工具被广泛运用于蛋白表达、基因沉默等研究,当前普遍使用的是以烟草花叶病毒载体等为代表的草本植物病毒载体,但其大多不能侵染果树,且稳定性较差,容易丢失插入的外源基因,因此该类载体无法满足果树等多年生植物研究的需要。近年来新兴的果树病毒载体可解决这些难题,为此作者对果树病毒载体的研究进展和发展方向进行综述。当前国内外取得的研究成果主要包括：（1）通过掌握柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒、葡萄病毒A和葡萄卷叶伴随病毒等果树病毒的传播途径、寄主范围、致病力分化、基因功能和表达策略等特性,采用体外转录或农杆菌介导的方式获得了上述果树病毒的全长侵染性克隆。在此基础上,通过在病毒外壳蛋白基因与其邻近的上游基因之间插入外源基因（包括荧光蛋白基因和β-葡萄糖醛酸酶基因等报告基因）,并用该病毒外壳蛋白基因的启动子或其他异源启动子驱动外源基因表达的方式,将上述6种果树病毒的全长侵染性克隆改造成为病毒载体;（2）运用果树病毒载体明确了柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒和葡萄卷叶伴随病毒在植株中的分布、移动规律,及其在细胞中的定位。探寻了柑橘衰退病毒在大翼来檬上产生茎陷点症状的原因,以及交叉保护防治柑橘衰退病的主要机理。果树病毒载体还被作为病毒诱导的基因沉默载体用于基因功能和防病研究;（3）通过选用本地已经存在,且无虫传能力的弱毒株,以及对控制病毒致病和媒介传播能力的基因进行敲除、突变可以解决果树病毒载体研发过程中所遇到的安全风险。由于有些果树病毒仅分布于植株的韧皮部,因此限制了其作为病毒载体在植株中表达外源基因的范围,但由这类果树病毒构建的病毒载体稳定性极高,并且通过添加分泌信号肽基因等方式可以扩大表达产物在植株中的分布和作用范围,因此其在果树病毒研究方面仍然具有很高的应用价值。此外,采用不同病毒来源的异源启动子代替同源重复区来驱动外源基因的表达,可以进一步提高果树病毒载体的稳定性。     

狂犬病毒G基因主要抗原表位区（Rmg）的表达及纯化

【目的】对狂犬病毒Rmg基因进行克隆、表达、纯化及复性,以期获得表达量高、反应原性好的Rmg蛋白,为研制快速、直观、简便检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条奠定基础。【方法】用常规PCR从狂犬病毒基因组中克隆出狂犬病毒G蛋白的主要抗原表位基因Rmg,并将其插入原核表达载体pET-Trx中,构建原核表达质粒pET-Trx-Rmg,将pET-Trx-Rmg转化BL21（DE3）plysS,在IPTG诱导下进行表达。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Rmg基因在BL21（DE3）plysS中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的30.5%左右,并主要以不溶的包涵体形式存在,分子量约为51.7kDa。将表达的蛋白以亲和层析法进行纯化并通过谷胱甘肽还原法进行复性,纯化后蛋白纯度达99.1%。经Western blotting检测,发现表达的Rmg蛋白能够与狂犬病毒高免血清发生特异反应,但与犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）阳性血清不发生反应。【结论】Rmg蛋白具有良好的抗原性,可用于研制检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条。     

eGFP标记狂犬病病毒G基因与EgM123基因重组融合蛋白的表达与鉴定

【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV₉病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性,     

狂犬病毒G基因主要抗原表位区（Rmg）的表达及纯化

【目的】对狂犬病毒Rmg基因进行克隆、表达、纯化及复性,以期获得表达量高、反应原性好的Rmg蛋白,为研制快速、直观、简便检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条奠定基础。【方法】用常规PCR从狂犬病毒基因组中克隆出狂犬病毒G蛋白的主要抗原表位基因Rmg,并将其插入原核表达载体pET-Trx中,构建原核表达质粒pET-Trx-Rmg,将pET-Trx-Rmg转化BL21（DE3）plysS,在IPTG诱导下进行表达。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Rmg基因在BL21（DE3）plysS中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的30.5%左右,并主要以不溶的包涵体形式存在,分子量约为51.7 kDa。将表达的蛋白以亲和层析法进行纯化并通过谷胱甘肽还原法进行复性,纯化后蛋白纯度达99.1%。经Western blotting检测,发现表达的Rmg蛋白能够与狂犬病毒高免血清发生特异反应,但与犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）阳性血清不发生反应。【结论】Rmg蛋白具有良好的抗原性,可用于研制检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条。     

HARDY基因植物表达载体的构建及在番茄中的遗传转化

HARDY(HRD)是AP2/ERF-like家族转录因子的一员,已有的研究表明它的过量表达可以增强水稻的抗旱性、提高水稻的水分利用效率.为了研究它是否在其他的农作物中具有普遍的适用性,本试验从拟南芥中克隆了HRD基因,成功构建了HRD基因的高效植物表达载体pBIN-HRD.采用农杆菌介导法转化番茄(亚心87-5),经PCR、RT-PCR分析表明,阳性的转HRD基因植株已获得表达.     

狂犬病病毒SRV_9株修饰全长基因组cDNA克隆的构建

为获得狂犬病病毒(rabies virus,RV)SRV9株的基因组全长cDNA克隆并对其进行基因修饰,深入研究狂犬病病毒的基因组特性及构建新型病毒载体,本研究根据GenBank中公布的SRV9基因组序列设计数对引物,以SRV9病毒为材料,从病毒总RNA中将全长基因组11 928 bp分5段扩增,克隆至载体测序鉴定。测序正确后,设计引物缺失基因组Ψ区并在缺失位置插入人细胞色素C基因,又设计引物删除糖蛋白(G)胞质区(CD区)。利用引物在病毒基因组起始处添加锤头状核酶序列,在病毒序列结尾处添加了丁型肝炎核酶序列。再次测序后克隆至pcDNA3.1(+)载体,利用扩增片段自身内切酶位点顺次进行修饰后全长连接,从而获得含修饰SRV9全长基因组的质粒pcDNA3.1-SRV9,为RV感染性克隆的建立奠定了基础。     

一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010（简称DK/NJ /1102）进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。     

CRISPR/Cas13b系统对猪流行性腹泻病毒增殖的抑制作用

【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。