环介导等温扩增技术检测酸乳中蜡样芽孢杆菌

目的：建立快速准确检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的方法.方法：根据蜡样芽孢杆菌hblA基因设计特异性引物,通过环介导等温扩增技术（LAMP）直接检测酸乳中蜡样芽孢杆菌,扩增产物电泳检测.结果：LAMP法检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的特异性强,方法检出限6.4CFU/mL,人工污染检出限21CFU/mL.结论：LAMP法用于检测酸乳中蜡样芽孢杆菌的灵敏度高、耗时短,为酸乳中蜡样芽孢杆菌的快速检测提供了新的方法.     

沙门菌LAMP检测方法的建立

建立了一种沙门菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法。依据GenBank公布的沙门菌属fimY基因序列,利用Primer Explorer V5软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法,并对其特异性和敏感性进行了评价。结果表明,针对fimY基因建立的LAMP方法具有较强的特异性,最低可检出浓度为56×102CFU/mL,灵敏度高于PCR方法 10倍。     

沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速检测,根据沙门氏菌特异性invE、hilA、invA、hut基因编码区序列,分别设计合成4套引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增检测方法。本方法对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到101CFU/mL (细菌浓度),其灵敏度比普通PCR高10倍且反应结果易于观察。以6种沙门氏菌和8种非沙门氏菌细菌DNA为模板进行LAMP扩增检测,并无交叉反应。结果显示,设计的LAMP引物组和建立的沙门氏菌的LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、费用低廉等优点,可应用于动物和食品样品中肠道沙门氏菌6个亚种的快速检测。     

环介导恒温扩增(LAMP)-检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu/mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

快速检测大肠杆菌O157的LAMP方法的建立与评价

利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验.结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果.在灵敏度试验中,rfbE-LAMP对O157菌液和模拟阳性样品的最低检测限分别为1CFU/mL和1 CFU/g.在特异性试验中,以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板对rfbE基因进行检测,均没有发生非特异性扩增反应.试验建立的LAMP检测方法具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求.     

环介导恒温扩增（LAMP）——检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu／mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

布鲁杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

研究针对布鲁杆菌保守的OMP25基因设计了4条LAMP的特异性引物,通过优化反应条件,建立了布鲁杆菌的LAMP快速检测方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测布鲁杆菌,其最低检测限为5 copies/μL.扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应进行判定.LAMP可以快速、直观、准确地检测布鲁杆菌,是一种适合基层现场应用的检测方法.     

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。     

志贺氏菌可视浊度/荧光环介导等温扩增方法的建立

为给实验室和现场检测提供一种快速且易于操作的志贺氏菌检测方法,通过将LAMP技术分别与荧光检测技术和浊度检测技术相结合,建立了灵敏、特异、准确的可视浊度/荧光环介导等温扩增(LAMP)检测方法。根据志贺氏菌基因保守序列,利用LAMP在线软件设计4条最佳引物,通过优化反应温度,分别建立了可视浊度环介导等温扩增检测方法(LAMP-浊度)以及可视荧光环介导等温扩增检测方法(LAMP-荧光),并分析所建立的两种方法的特异性和灵敏度。结果显示:所建立的LAMP-浊度方法最适反应温度是63℃,菌液灵敏度为13.6 cfu/mL,是普通PCR方法的10倍;所建立的LAMP-荧光方法最适反应温度是64℃,菌液灵敏度为1.36 cfu/mL,是普通PCR方法的100倍。利用4株志贺氏菌和10株非志贺氏菌,证实了建立的两种可视化LAMP方法具有良好的特异性。通过环介导等温扩增技术分别与浊度检测技术和荧光检测技术相结合,使其完成时间缩短至1 h内,整个扩增过程可实时监测,并可避免由于开盖加染料而导致的假阳性。     

基于DNA环介导等温扩增技术快速检测溶藻弧菌的研究

溶藻弧菌是引起海产鱼类、虾、贝等细菌性疾病的主要病原之一,严重危害水产养殖业的发展,建立快速、准确的检测方法对防控溶藻弧菌及保障水产养殖安全具有重要意义。本研究引入环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,以溶藻弧菌胶原酶基因为靶基因,建立了溶藻弧菌LAMP快速检测方法,45~60 min内即可完成检测。试验结果显示,该LAMP方法可特异性检测溶藻弧菌,且灵敏度高,对纯培养溶藻弧菌的检测灵敏度约10 CFU/mL,对污染水产品中溶藻弧菌的检测灵敏度为19 CFU/mL。本研究建立的溶藻弧菌LAMP检测方法操作简便、检测快速,具有良好的实用性。     

LAMP技术快速检测食源性沙门菌hisJ基因方法的建立

为建立一种快速检测食源性沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)方法,依据Gen Bank公布的沙门菌属hisJ基因序列,利用Primer Explorer软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法。选取鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌、伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌及其他6种常见食源性细菌进行特异性试验,并对其灵敏性进行了评价。针对hisJ基因建立的LAMP方法,在63℃水浴1 h便可完成沙门菌的有效扩增,该方法的灵敏度达到102cfu/mL,高于PCR方法 100倍,特异性试验结果显示只有沙门菌LAMP扩增结果呈阳性。本研究建立的沙门菌hisJ基因LAMP检测方法具有较强的特异性及灵敏性,可用于食品中沙门菌的快速检测。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条检测技术(lateral flow dipstick,LFD)联合,建立了1种可应用于单核细胞增生李斯特菌快速检测的新方法。针对单核细胞增生李斯特菌的actA基因设计3对引物(其中,上游内引物由生物素标记)和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针,进行由生物素标记的LAMP扩增反应,并利用LFD对经FITC标记探针杂交的扩增产物完成检测。优化后的LAMP反应条件为65℃反应40min,从细菌基因组DNA提取到LFD结果判断只需90min左右,比常规PCR技术缩短近2h。LAMP-LFD可特异性地检出单核细胞增生李斯特菌,对哈维弧菌等常见弧菌及嗜水气单胞菌等的检测结果为阴性。灵敏性试验表明,LAMP-LFD针对病原纯培养物的检测灵敏度为3.2×101 CFU/mL或0.64CFU/反应,是LAMP检测的10倍,常规PCR检测的100倍;针对人工污染单核细胞增生李斯特菌的原料奶样品的检测灵敏度为1.6×102 CFU/mL或3.2CFU/反应。利用本方法可从采集样品中检测到单核细胞增生李斯特菌,检测结果与传统的细菌分离培养方法结果一致。试验表明,本研究建立的LAMP-LFD技术可特异、准确地应用于单核细胞增生李斯特菌检测,而且灵敏度高、操作简单、检测成本低,有望发展成为单核细胞增生李斯特菌快速检测的有效手段。     

犬细小病毒环介导等温扩增快速检测方法的初步建立

为建立犬细小病毒(CPV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,实现CPV的早期快速诊断,本研究根据GenBank登录的CPV VP2基因序列,在其序列保守区域设计LAMP引物,利用CPV基因组DNA为模板进行扩增。结果表明:LAMP方法检测灵敏度达到10-1TCID50/mL;并且与其它细小病毒等无特异性扩增,表现出良好的特异性。与PCR技术相比,LAMP法操作更加简单方便,更适合基层和实验室的快速检测。     

环介导等温扩增法检测牛奶中结核分枝杆菌条件的优化

为优化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）法检测牛奶中结核分枝杆菌的条件,以结核分枝杆菌高度保守的16S rRNA基因为靶基因设计3对特异性引物（F3-B3、FIP-BIP、FLP-BLP）进行试验。比较改良后的CATB/NaCl法、细菌基因组DNA提取试剂盒及热裂解法提取其DNA的效率,确定最佳的提取方法。用灭菌处理过的牛奶对结核分枝杆菌悬液进行倍比稀释以确定该检测方法的敏感度。以牛奶中常见的布鲁氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、巴氏杆菌、沙门氏菌为对照,对该方法进行特异性测试。结果表明,改良后的CTAB/NaCl法对牛奶中结核分枝杆菌DNA的提取效果要优于其他两种方法。LAMP法检测结核分枝杆菌的灵敏度为3×10⁰ CFU/mL,对人工阳性乳中结核分枝杆菌检测的灵敏度为3×10¹ CFU/mL。     

沙门菌LAMP检测方法的建立

为动物产品沙门菌快速检测提供技术支持,针对沙门菌属特异性的侵袭蛋白(Invasion protein,invA)基因设计2对引物,建立了一种环介导等温扩增(Loop-mediated iso?thermal amplification,LAMP)方法。对优化后的LAMP方法进行了特异性检测、灵敏度检测及沙门菌人工污染鸡蛋内容物检测。结果表明,该LAMP法可快速、特异地检测出沙门菌。LAMP法对细菌培养物检出限为8.7×100cfu/mL,对人工污染鸡蛋内容物中沙门菌的检出限为9.5×100cfu/mL。该方法有望用于鸡蛋中沙门菌的快速检测。     

一种金黄色葡萄球菌核酸检测方法的建立

通过对金黄色葡萄球菌的fem A基因设计两对特异性引物,运用环介导等温扩增技术(LAMP)扩增基因的特定区域,探索出一种金黄色葡萄球菌的快速检测方法。结果表明,该方法对金黄色葡萄球菌菌液检测的最低检出浓度为10~2～10~3CFU/Ml;使用不同浓度的金黄色葡萄球菌处理样品,不同样品LAMP方法检测结果与国标方法一致,两者符合率为100%。该方法中金黄色葡萄球菌的fem A基因特异性引物及建立的LAMP方法能有效检测食品中的金黄色葡萄球菌,操作简单、检测速度快、灵敏度高、特异性强,适用于不同层级的实验室及基层单位使用。     

Q热贝氏柯克斯体环介导等温扩增实时浊度检测法的建立

根据Q热贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)插入序列IS1111序列设计1套特异性引物,建立快速检测Q热的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)实时浊度检测方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,在恒温反应条件下,对靶基因的特定区域进行扩增,建立LAMP检测方法。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒,而对结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(C.psittaci)、布鲁氏杆菌(Brucella.spp)及部分牛血液的核酸样本的特异性检测结果均为阴性,无交叉反应。本研究建立的LAMP实时浊度检测方法灵敏度高、特异性好,在Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

牛传染性鼻气管炎病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,采用针对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因保守序列设计的特异引物,优化反应条件,建立了IBRV LAMP检测方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的LAMP方法具有良好的特异性,其检出灵敏度为10~3 copies/μL,仅需1 h即可肉眼观察检测结果。结果表明,本试验建立的LAMP方法可用于IBRV的进出口检疫。     

绵羊肺炎支原体环介导等温扩增联合横向流动 试纸条可视化检测方法的建立

为建立绵羊肺炎支原体快速检测方法,用环介导等温扩增(LAMP)技术进行核酸扩增,通过横向流动试纸条(LFD)实现可视化检测。针对绵羊肺炎支原体HSP 70基因设计一套特异性引物,其中HSP70FIP由生物素标记进行LAMP扩增反应,产物与生物素标记的探针杂交后,在LFD上完成检测,建立了绵羊肺炎支原体LAMP-LFD快速检测方法,并对其特异性、敏感性及临床应用进行检测。结果表明,LAMP在62℃反应70min,即可特异性的检测绵羊肺炎支原体的存在,最低检测线为1.0×102 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的100倍,且对已知感染绵羊肺炎支原体的羊病变肺组织临床样品的检出率为100%。建立的LAMP-LFD检测绵羊肺炎支原体的方法特异性强、灵敏度高并且操作简便,为羊感染绵羊肺炎支原体的预防和诊断提供了新方法。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测迟缓爱德华菌

将环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与横向流动试纸条(latera flowdipstick,LFD)联合应用,建立LAMP-LFD方法,用于迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)的快速检测。根据E.tarda外膜蛋白A(outer membrane protein A,ompA)基因的保守区设计了6套LAMP引物,并筛得1套最适引物用于后续LAMP反应。将该套引物的上游内引物5′端用生物素标记,同时在有效扩增区段内设计1条探针ompAHP,使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记,用于试纸条显色。结果表明,优化后的LAMP反应条件为63℃ 25min,LAMP-LFD对嗜水气单胞菌等致病菌检测结果均呈阴性,对病原菌纯培养物的检测灵敏度为1.0×10~2 CFU/mL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。对E.tarda人工污染组织样品的灵敏度为5×10~2 CFU/mL或1.0×10~4 CFU/g。因此,LAMP-LFD可特异地检出E.tarda,且灵敏度高、操作简便、时间短、有潜力成为检测E.tarda的常规方法。