羊传染性脓疱病毒122蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

以提取的羊传染性脓疱病毒(ORFV)基因组为模版,PCR扩增ORFV122基因,并将该基因连接至原核表达载体pET-28a上,构建出pET-28a-122重组表达质粒。然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经IPTG诱导后成功表达出ORFV122蛋白。利用His标签可与镍离子结合的特性对ORFV122蛋白进行分离纯化。将纯化后的ORFV122蛋白免疫BALB/c小鼠,制备相应的多克隆抗体,并利用Western blot技术检测该抗体的特异性。免疫小鼠获得的抗ORFV122蛋白多克隆抗体经ELISA检测,其效价约为1∶80 000。此外,使用该抗体对ORFV122蛋白的表达规律进行了研究,发现ORFV122蛋白为早期表达蛋白。本试验获得的ORFV122蛋白多克隆抗体为以后ORFV122基因功能的后续研究奠定基础。     

非洲猪瘟病毒p17蛋白的哺乳动物细胞表达及鉴定

研究旨在利用哺乳动物细胞悬浮培养系统表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p17蛋白,纯化并免疫小鼠,制备针对ASFV p17蛋白的特异性多克隆抗体。根据GenBank中公布的ASFV SY18毒株p17蛋白编码基因序列,设计特异性引物扩增p17基因片段,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-p17-strep。将其瞬时转染293i细胞,并利用下游strep标签进行蛋白纯化。纯化后的重组p17蛋白配合MnJ(β)胶体锰佐剂免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。利用Western blot、间接免疫荧光试验鉴定该多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示：本试验成功构建pCDNA3.1-p17-strep真核表达质粒,转染293i细胞后纯化获得重组p17蛋白。免疫小鼠后制备的多克隆抗体与真核表达的p17蛋白及表达ASFV p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒均有良好的特异性免疫反应。本试验为深入探讨ASFV p17蛋白的生物学功能奠定了基础。     

水泡性口炎病毒M基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

为制备水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)重组M蛋白的鼠源多克隆抗体,本研究将扩增的VSV-M基因插入到pET-28a载体中,构建了pET-28a-VSV-M原核表达载体,将其转化至大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达;SDS-PAGE和Western blot检测结果发现重组蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为31 000。之后应用His GraviTrap 10prepacked gravity flow columns纯化重组M蛋白,并将其免疫小鼠,制备VSV重组M蛋白的多克隆抗体;间接ELISA方法检测其抗体效价为1∶12 800。将该抗体应用于VSV的检测,在稀释倍数为1∶800时仍可检测到清晰的条带,且大小与预期的一致,证实了其与病毒的特异性结合。结果表明,本研究成功构建了VSV-M蛋白的原核表达载体,将表达纯化后的VSV-M蛋白免疫小鼠成功制备了VSV-M蛋白的多克隆抗体,这为后期检测VSV-M基因的表达分布、功能特性及开发诊断试剂和疫苗的研制奠定了基础。     

马流产沙门菌鞭毛蛋白FliC对马腺疫链球菌SeM蛋白免疫效应分析

为研究马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)鞭毛蛋白FliC对马腺疫链球菌(Streptococcus equi subsp.equi)SeM蛋白免疫效果的增强效应,为马腺疫新型高效疫苗的研发奠定基础。本研究构建并诱导表达了FliC,经亲和层析纯化目的蛋白,Western blot检测其免疫原性。将该纯化后FliC与SeM蛋白联合免疫C57BL/6小鼠,免疫后对小鼠进行抗体水平、抗体类型和攻毒保护力的检测。结果表明,成功表达、纯化了FliC重组蛋白,SDSPAGE电泳检测显示该蛋白质为52ku。抗体分型检测结果显示产生的抗体主要以IgG1为主;免疫30d后FliC+SeM免疫组的攻毒保护率为87%,高于SeM免疫组的保护率67%。马流产沙门菌来源的鞭毛蛋白FliC能够增强SeM蛋白的免疫保护效果,该结果为进一步更好地利用SeM蛋白奠定了基础。     

奶牛早孕因子重组蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

本研究旨在表达、纯化奶牛早孕因子重组蛋白及制备多克隆抗体.本试验构建奶牛早孕因子重组蛋白原核表达载体pET32a-EPF,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的早孕因子重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对重组蛋白及抗体进行检测.结果显示,成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,重组蛋白分子质量约37 ku,表达量约占菌体总蛋白的48.6%,纯化后目的蛋白纯度可达93%,重组蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1:12 800.结果表明,本研究成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,为研究奶牛早孕诊断奠定基础.     

日本脑炎病毒prM蛋白的表达及免疫原性分析

日本脑炎是一种由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的、经虫媒传播并可导致母猪流产的急性病毒性传染病。JEV的M蛋白参与病毒的感染过程且能诱生具有轻度中和作用的抗体。本研究提取JEV上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增该病毒的prM基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-prM,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组his-JEV-prM蛋白,SDS-PAGE结果表明,获得分子量大小为24 ku的重组蛋白,主要以包涵体形式表达,薄层扫描分析表明,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,占总蛋白比例达60%以上。纯化蛋白his-JEV-prM免疫BALB/c小鼠,制备了小鼠抗JEV-prM抗体,Westernblotting和间接免疫荧光检测小鼠抗JEV-M抗体的特异性。纯化蛋白能诱导小鼠产生高滴度抗体,并且该抗体能特异识别原核、真核和病毒表达的prM。本研究表达纯化的prM蛋白和小鼠抗prM抗体,为基于M蛋白的疫苗开发、检测JEV的方法及致病机理研究提供了工具。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。     

猪星状病毒1型衣壳蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备

为制备猪星状病毒1型(PAstV1)Cap蛋白高变区特异性多克隆抗体,本研究根据PAstV-GX1株Cap蛋白Cs(aa420～aa669)基因序列设计引物,PCR扩增该片段(Cs)后克隆于pET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-Cs,将其转化E. coli BL21感受态细胞,经终浓度1 mmol/L的IPTG在37℃诱导6 h后经SDS-PAGE检测表达产物,结果显示在大约47 ku处出现目的蛋白,且该蛋白以可溶性形式表达。将重组Cs蛋白经Ni柱纯化后乳化,按100μg/只免疫6周龄BALB/c小鼠,三免后5 d采血分离血清,经western blot和间接免疫荧光检测结果显示,获得的Cap蛋白高变区多克隆抗体可特异性识别PAstV-GX1感染的PK15细胞表达的病毒蛋白。本研究首次制备的PAstV Cap蛋白高变区纯化蛋白及其多克隆抗体为后续PAstV病原学研究奠定了基础。     

猫疱疹病毒Ⅰ型US3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3蛋白的多克隆抗体,本研究通过PCR方法扩增US3基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-US3;然后转化大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG诱导表达His-US3重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot试验表明,该重组蛋白为可溶性表达,并且具有较好的反应原性。将切胶纯化后的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1:10,000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与US3蛋白特异性结合。US3多克隆抗体的制备为US3缺失株的检测及进一步研究US3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌强菌株rpoE蛋白的原核表达及其免疫保护效力研究

为研究牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(PM)强菌株rpoE蛋白的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增牛荚膜A型PM的rpoE基因,构建pET-28a-rpoE重组表达质粒,经诱导表达后SDS-PAGE检测结果显示,表达的rpoE蛋白相对分子量约为20 ku,与理论值一致;western blot结果显示该蛋白具有很好的特异性和反应原性;纯化的rpoE蛋白经皮下免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测融合蛋白的免疫原性,结果显示rpoE蛋白可以诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体;PM攻毒后,免疫组保护率为70%。本研究获得的牛荚膜A型PM重组rpoE蛋白具有良好的免疫原性,免疫小鼠后能够提供一定的保护,可以作为研发PM亚单位疫苗的候选抗原。     

一株H5N3亚型禽流感病毒全基因组序列分析及其对小鼠的感染性研究

为了解H5N3亚型流感病毒的生物学特性,本研究对2017年浙江省分离到的一株H5N3亚型禽流感病毒(AIV)[DK/ZJ/S1368/2017(H5N3)]进行了遗传演化分析及小鼠感染性实验。遗传演化分析结果显示,该株病毒的HA蛋白裂解位点处仅含一个碱性氨基酸,属于低致病性AIV。同时,该病毒的血凝素(HA)基因与H5N7亚型流感病毒亲缘关系较近;聚合酶碱性蛋白2(PB2)基因和核蛋白(NP)基因与H10N7亚型流感病毒亲缘关系较近;碱性聚合酶蛋白1(PB1)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近;酸性聚合酶蛋白(PA)基因与H6N2亚型流感病毒亲缘关系较近;神经氨酸酶(NA)基因与H10N3亚型流感病毒亲缘关系较近;基质蛋白(M)基因与H3N8亚型流感病毒亲缘关系较近;非结构蛋白(NS)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近。表明其基因来源复杂。小鼠感染实验结果显示,该分离株无需提前适应即可以在小鼠肺脏和鼻甲中复制,小鼠感染病毒后无明显临床症状,与对照组相比其体质量变化不明显,表明该病毒对小鼠呈低致病性。本研究通过对该H5N3亚型AIV的生物学特性的分析,发现该病毒基因来源复杂,无需提前适应就可以在小鼠体内复制,具有感染哺乳动物的潜在威胁,提示应当持续加强对H5N3亚型AIV的监测和相关生物学特性的研究工作。     

利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_tufA-cre质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。     

猪链球菌2型05ZYH33菌株具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性蛋白的鉴定及功能研究

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(S.pneumoniae)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;经基因克隆、蛋白表达及纯化后的酶活性分析表明Ss GH20具有NAG活性,且其活力为371 U/mg蛋白;其最适反应温度为50℃、最适p H为5.5;其Km值为0.69。通过构建SS2 ssu050630基因缺失株及全菌酶活性测定,显示SS2 05ZYH33菌株具有NAG活性,而ssu050630基因缺失后的菌株则失去了NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株唯一具有NAG活性的蛋白。本研究为进一步探究Ss GH20在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制奠定了基础。     

人工感染鸭源新城疫病毒对绍鸭β-防御素和细胞因子基因表达的影响

试验旨在探讨人工感染鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对绍鸭β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)和细胞因子基因表达的影响。选用45只20日龄SPF绍鸭,随机分为攻毒组(27只)和对照组(18只),攻毒组采用滴鼻点眼的途径(108.38 EID50)接种鸭源NDV强毒株(Md/CH/LGD/1/2005),对照组接种磷酸盐缓冲液。在攻毒后24和48h,从对照组及攻毒组各随机取6只鸭屠宰,分别采集肾脏、肺脏、气管、腺胃、骨髓、脾脏、盲肠扁桃体、哈德氏腺、法氏囊9个组织,运用实时荧光定量PCR法检测组织样品中9种AvBDs和细胞因子的表达量;剩余鸭每天持续观察,每隔4d采血1次,直至24d,检测血清抗体水平;于攻毒后24、48、72和120h采集咽喉及泄殖腔拭子,以确定排毒周期。结果表明,感染该NDV毒株后,鸭没有临床发病症状和死亡情况发生;感染后鸭排毒开始于攻毒后第1天,到第5天停止,在攻毒组咽喉及泄殖腔拭子中均检测到NDV。抗体水平检测结果显示,该NDV能够诱导鸭体内产生抗NDV特异抗体。实时荧光定量PCR结果发现,与对照组相比,感染后24h,部分鸭组织中AvBD1、AvBD2、AvBD5、AvBD6、AvBD9和AvBD16表达量均显著升高(P<0.05);感染后48h,AvBD1和AvBD6在部分鸭组织中表达量均显著上调(P<0.05);感染后48h法氏囊中白细胞介素6(IL-6)和脾脏中干扰素γ(IFN-γ)的表达量明显低于感染后24h的表达量。综上所述,该鸭源NDV毒株感染可诱导绍鸭体内在早期产生天然免疫反应,这些反应可能与病毒在机体内复制有关。     

猪链球菌2型05ZYH33菌株启动子的筛选和鉴定

为了筛选和鉴定用于猪链球菌(S.suis)致病因子和致病机制研究的启动子,本研究通过质谱鉴定了来自S.suis2型05ZYH33菌株的5个高丰度蛋白质,并通过其驱动GFP蛋白和甘露糖苷酶SSU05_1921的表达水平,评估了这5个蛋白相应的基因启动子的强弱。结果显示,这5种蛋白质分别为SSU05_0177、SSU05_0530、SSU05_1503、SSU05_1815和SSU05_1868,相应的5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815和P1868均能够有效驱动GFP在E.coli和S.suis中的高水平表达,但是P1815、P0177和P1868不能驱动SSU05_1921在S.suis中的表达。P0530和P1503能够驱动SSU05_1921在S.suis中的表达,并且P1503启动子驱动GFP和SSU05_1921的表达水平均比P0530启动子驱动的高两倍以上。因此,P0530和P1503是S.suis的强启动子,并且P1503更强于P0530。这在高水平表达GFP用于标记菌体,以及构建无启动子基因的回复突变菌株中发挥关键作用,在S.suis遗传操作中具有很好的应用前景。     

嵌合猫杯状病毒F9株感染性克隆的构建及病毒拯救

为构建猫杯状病毒(FCV)弱毒株F9的感染性克隆,本研究利经PCR分段扩增了FCV各基因片段,并拼接出FCVF9全基因组序列。经测序显示,其1823位多出一个碱基造成该序列存在移码突变,经替换为pOK-2280(已构建出的FCV强毒株的感染性克隆)相应序列并对差异氨基酸逐个突变,最终获得嵌合FCVF9全基因组的重组质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H体外转录,获得的加帽RNA转染F81细胞,得到了拯救病毒rFCVF9。经过对拯救病毒与亲本病毒的蚀斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果显示rFCVF9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明构建了嵌合FCVF9株的感染性克隆并拯救出重组病毒。本研究构建的嵌合FCVF9株感染性克隆可以为FCV的基因功能研究以及新型FCV疫苗的研发奠定基础。     

不同施肥方案对野大麦产草量及营养品质的影响

野大麦（Hordeum brevisubulatum（Trin.） Link.）是治理东北地区盐碱退化草地的重要牧草,科学合理的施肥能够有效提高牧草的产草量及营养品质。本试验研究了不同施肥时期及施肥量对野大麦干草产量及营养品质的影响。施肥时期分别为返青期,拔节期和抽穗期,施肥量设225,300,375,450,525,600 kg·hm^-26个水平,以不施肥做为对照。结果表明：施肥可有效提高野大麦干草产量和营养品质,其中在拔节期,施肥量为525 kg·hm^-2时施肥效果最佳,其干草产量达5.93t·hm^-2,比对照（不施肥）增加了51.27%;粗蛋白含量为12.98%,比对照增加了92.01%;粗脂肪的含量为3.64%,比对照增加了195.93%。     

沙门氏菌菌蜕佐剂增强结核分枝杆菌4种蛋白的免疫作用研究

探究肠炎沙门氏菌菌蜕(ghost)佐剂对结核分枝杆菌(MTB)4种抗原的免疫增强作用,本研究以MTB中的Rv3802、Rv0394c(SEC)、Rv0199及E6c10(ESAT6与CFP10融合蛋白)蛋白为免疫原,应用小鼠模型评价沙门氏菌菌蜕对MTB4种抗原的免疫佐剂效应。结果显示,蛋白加菌蜕佐剂组可以刺激小鼠产生持久高水平的抗体,并且菌蜕佐剂的免疫增强效果高于弗氏不完全佐剂;IgG1/IgG2a的比率增高,提示蛋白加菌蜕佐剂组小鼠趋向于Th2型免疫反应,同时可以诱导淋巴细胞分化为CD4+T细胞亚群并产生IFN-γ及IL-4细胞因子;病理组织学显示以菌蜕佐剂配伍蛋白制备的亚单位疫苗具有良好的安全性。本研究为结核病的预防和新型疫苗的研发奠定了一定的基础。     

肠炎沙门菌mreB基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究

MreB蛋白广泛存在于原核生物中,主要生物功能是聚合形成类似于肌动蛋白微丝的纤维,参与细胞形状的维持。为研究肠炎沙门菌的mreB基因缺失对环境压力的应激变化,本研究利用Red重组方法构建肠炎沙门菌SM6株的mreB基因缺失株,同时构建其回补菌株,观察缺失株SM6ΔmreB的形态学变化,分析其对温度缺氧应力、渗透应力以及耐酸性的变化。结果显示,缺失株SM6ΔmreB的菌体变为球状,生长受到抑制;SM6ΔmreB对升温缺氧压力的耐受能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05);在渗透压条件为100mmol/L和200mmol/LNaCl时缺失株的生存能力明显弱于亲本株和回补株(p<0.05);缺失株在强酸环境中的生存能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05),而对中性和弱酸性环境的适应能力与亲本株相似。本研究为进一步探究MreB蛋白在沙门菌的致病机制以及菌蜕形成过程中的作用奠定了基础。     

猪IL-21的真核表达及其与CD40L共刺激抗体分泌的活性研究

为研究猪白介素21(IL-21)的生物学功能,本研究在猪IL-21基因(456 bp)的3’端加上猪Ig G Fc标签序列后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组质粒pcDNA-IL-21-Fc。将该重组质粒转染293T细胞瞬时表达后,利用protein A亲和纯化介质纯化转染上清中的目的蛋白,并检测其纯度与生物学活性。结果显示,构建的重组质粒pcDNA-IL-21-Fc能够在293T细胞中表达相对分子量约为44 ku的猪IL-21融合蛋白;亲和纯化后的猪IL-21融合蛋白能够与CD40L协同呈剂量依懒性地刺激猪外周血淋巴细胞(PBMCs)分泌Ig G。本研究为进一步探究猪IL-21在适应性免疫应答中的作用提供依据。