肠炎沙门菌C50336ZinT基因缺失株构建及其相关生物学特性

为研究锌调控蛋白ZinT在肠炎沙门菌致病中的作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336)ZinT基因缺失突变株(C50336ΔZinT),并对其生物学特性进行分析。结果显示,与野生型菌株和回复菌株相比,缺失株C50336ΔZinT在LB培养基中生长速度无明显差异,生化特性亦无明显变化,但其在Minimal培养基中生长明显变慢。此外缺失株C50336ΔZinT对H_2O_2处理和高渗环境的适应能力显著下降,但在巨噬细胞内的存活率无明显降低。动物试验表明,ZinT基因缺失突变株的毒力和野生型菌株相比仅有轻微下降。本试验探讨了ZinT与肠炎沙门菌锌摄取和毒力间的联系,为进一步阐释肠炎沙门菌感染致病机制奠定基础。     

肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因缺失株的毒力相关功能研究

为研究肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因在肠炎沙门菌感染中的毒力作用,利用Red同源重组系统对2株肠炎沙门菌(国内标准株50336和国际参考株SD-2)SPI-19的Hcp基因进行敲除,成功构建了50336ΔHcp和SD-2ΔHcp基因缺失株,并构建了回补株50336ΔHcp/pHcp和SD-2ΔHcp/pHcp。分析比较缺失株与野生株对人肠上皮细胞系Caco-2黏附和侵袭能力,以及在鸡巨噬细胞HD11的存活能力。结果显示:缺失Hcp基因后,肠炎沙门菌50336对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降39.1%和47.9%;SD-2对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降46.5%和58.9%。吞噬作用2h后,50336ΔHcp和SD-2ΔHcp与野生株相比在HD11的存活量下降了35.7%和37.2%,差异显著。通过Real Time-PCR试验分析,与野生株相比,Hcp基因缺失后fliC、sefA、ompA,ompC这4个重要粘附因子编码基因的表达量显著下降。试验表明,肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因对肠炎沙门菌的毒力具有增强作用。     

肠炎沙门菌非编码小RNA isrC基因缺失株的致病性

细菌非编码小RNA(sRNA)是一类可在转录后水平调控基因表达的调节子。IsrC是存在于鼠伤寒沙门菌毒力岛上的一种与毒力相关的sRNA,可调节巨噬细胞存活蛋白MsgA的表达。本研究克隆了肠炎沙门菌50336菌株isrC基因,通过λ-Red同源重组系统构建了isrC缺失突变株50336△isrC,并利用表达载体pBR322构建了回补株50336△isrC/pisrC。将野生株,isrC突变株和回补株分别接种1日龄清远麻鸡,比较三者之间的致病性差异。结果显示,肠炎沙门菌isrC基因与鼠伤寒沙门菌同源性为100%;成功构建了isrC缺失突变株和回补株;野生株,突变株和回补株对雏鸡的半数致死量(LD50)分别为2.81×108 CFU,2.02×108 CFU和3.10×108 CFU,相比野生株50336,突变株50336△isrC的LD50明显下降,表明isrC基因的缺失增强了肠炎沙门菌的毒力。     

貉肠炎沙门菌htra基因缺失株的构建及生物学特性

为研究HtrA蛋白对貉源肠炎沙门菌毒力和生物学特性的影响,本试验利用Red同源重组方法对HtrA蛋白编码基因htra进行敲除,并从生长特性、生化特性、耐pH应激与氧化应激、抗血清杀伤和菌株毒力等方面对突变菌株进行评价,结果显示:与野生型菌株相比,htra基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其对酸性和碱性环境的敏感性增加,对血清的耐受力下降,动物实验结果显示htra基因缺失后肠炎沙门菌对小鼠半数致死量有显著提高。本试验成功构建貉肠炎沙门菌htra基因缺失株,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定了基础。     

肠炎沙门菌iroB基因缺失株的构建及部分特性分析

为研究糖基转移酶IroB对沙门菌的重要作用,本研究利用λ-Red重组技术构建了肠炎沙门菌iroB基因缺失突变株c50336ΔiroB,通过应激试验、胞内存活试验和药物耐受试验检测缺失iroB基因后肠炎沙门菌生物特性的变化。结果显示,iroB基因缺失并未影响细菌的生长速度和生化特性,也不影响其对酸、碱和过氧化氢的抵抗能力,以及其在细胞内的存活能力,但使得细菌对热应激的敏感性增加,对蛋清抵抗能力下降,推测IroB参与沙门菌对铁的利用和对多溶菌酶的耐受;利用多粘菌素B进行最低抑菌浓度试验,结果显示其耐该药能力降低。本研究结果揭示IroB能够促进肠炎沙门菌的抗应激能力和耐药性,阐释了糖基转移酶IroB在沙门菌致病过程中的作用。     

貉肠炎沙门菌htra基因缺失株的构建及其生物学特性

利用Red同源重组方法对HtrA蛋白编码基因htra进行敲除,并从生长特性、生化特性、耐pH应激与氧化应激、抗血清杀伤和菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果显示,与野生型菌株相比,htra基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其对酸性和碱性环境的敏感性增加,对血清的耐受力下降;动物试验结果显示,htra基因缺失后肠炎沙门菌对小鼠半数致死量有显著提高。本试验成功构建了貉肠炎沙门菌htra基因缺失株,为研究HtrA蛋白的作用机制奠定了基础。     

肠炎沙门菌icdA基因缺失株的构建及重要特性分析

为研究肠炎沙门菌异柠檬酸脱氢酶(IDH)的功能,本研究利用λ-Red重组技术构建了肠炎沙门菌IDH编码基因icdA缺失突变株c50336ΔicdA,对其进行生长和生化特性检测,并通过体外模拟应激试验、药敏试验、生物被膜检测、抗蛋清杀伤、胞内存活和动物感染实验,分析icdA基因在肠炎沙门菌致病机制中的重要作用。研究结果显示,icdA基因缺失不影响肠炎沙门菌的生长特性和生化特性,在热应激(42℃)、酸应激(pH3.5)和高渗应激(NaCl2.4mol/L)条件下其存活率也未出现显著变化,但icdA基因缺失能够显著降低肠炎沙门菌对碱、低渗透压和过氧化氢应激的抵御能力,降低肠炎沙门菌对多粘菌素B的耐药性和生物被膜的形成能力;同时,该基因缺失能够降低肠炎沙门菌对蛋清杀伤的防御能力、在巨噬细胞内的存活能力和其对小鼠的毒力。研究结果表明icdA基因参与肠炎沙门菌的抗应激能力、耐药性、生物被膜形成和抗蛋清杀伤能力,从而影响细菌的毒力。本研究为肠炎沙门菌疫苗的研究奠定了重要基础。     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。     

肠炎沙门菌双组份系统qseC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为研究肠炎沙门菌qseC基因功能,构建qseC缺失株C50041ΔqseC以及回复株C50041ΔqseC::qseC,分析qseC基因缺失对肠炎沙门菌生化特性、生长曲线、运动性、黏附侵袭等方面的影响,探究该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。结果显示:利用框内缺失突变技术成功获得肠炎沙门菌C50041ΔqseC缺失株,以野生株C50041、回复株C50041ΔqseC::qseC为对照,发现C50041ΔqseC缺失株的生化特性、生长曲线与C50041野生株一致,但其运动性(P=0.001 9)以及对巨噬细胞J774A.1的黏附率(P=0.032 5)、侵袭率(P=0.005 3)相比野生株显著下降。研究提示:qseC基因的缺失对肠炎沙门菌的生化特性和生长曲线没有影响,但会显著降低肠炎沙门菌的运动能力及对宿主细胞的黏附和侵袭。研究初步探究了肠炎沙门菌qseC基因的功能,为后续深入研究奠定基础。     

肠炎沙门菌非编码小RNA RyhB-1和IsrE对清远麻鸡的致病性

RyhB是一种大小为90bp左右的细菌非编码小RNA,已有研究表明存在于鼠伤寒沙门菌和霍乱弧菌中的2种RyhB同源物RyhB-1和IsrE可调控细菌生物膜形成、趋化性和耐酸性。为研究RyhB在肠炎沙门菌致病性上的作用,以及2种同源物能否对毒力调控发挥协同作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了ryhB-1和isrE单、双缺失株,利用表达载体pBR322和pACYC184分别构建了回补质粒并导入缺失株50336△ryhB-1,50336△isrE,50336△ryhB-1/△isrE中,获得各突变株相应的回补菌株,检测了野生株和各突变株对1日龄雏鸡半数致死量(LD50)、致死率、体内分布等致病性差异。结果发现,ryhB-1和isrE基因缺失后导致肠炎沙门菌毒力减弱,双基因缺失株毒力下降更为明显,表明2种小RNA均对肠炎沙门菌致病性具有增强作用,且二者对毒力的调控具有协同作用。     

肠炎沙门菌ArgG基因缺失株的构建及生物学特性分析

为研究ArgG基因对肠炎沙门菌的致病作用和生物学特性的影响，本试验利用λ-Red重组法构建肠炎沙门菌ArgG基因缺失株，并从生化特性、生长特性、生物被膜形成能力、运动能力、体外应激、巨噬细胞存活能力等方面进行研究。结果显示，与野生型菌株相比，ArgG基因缺失株生化特性、运动能力无明显变化，在LB培养基中生长速度变化不明显，但在M9培养基中缺失株不生长；ArgG基因缺失株生物被膜形成能力下降约60%,抗酸、碱应激能力分别下降约12%和10%左右，巨噬细胞内的存活能力和其对小鼠的毒力降低。本研究成功构建了肠炎沙门菌ArgG基因缺失株，并证明ArgG基因与营养代谢、抗应激能力和毒力密切相关，为肠炎沙门菌的基因缺失苗的研究提供理论依据。     

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛亚单位sefA和sefD基因缺失株的致病性研究

为研究SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌中的致病作用,本实验将SEF14菌毛亚单位编码基因缺失的肠炎沙门氏菌突变株50336△sefA和50336△sefD分别接种6周龄BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡,比较它们与其亲本菌株50336的致病性差异。结果显示,亲本菌株50336以及突变株50336△sefA、50336△sefD对小鼠的半数致死量分别为19.95 cfu、7.94 cfu和7.94 cfu,表明两个突变株对小鼠的致病性显著增强;而且对雏鸡的致病性结果也显示,突变株50336△sefA致病力较强,其感染雏鸡组死亡率为15%,而亲本菌株组死亡率为8.6%;另外50336△sefA和50336△sefD感染组7日龄时平均增重分别为15.38 g和18.39 g,亲本菌株组为19.06 g,对照组为26.43 g。研究结果表明SEF14菌毛亚单位基因缺失对肠炎沙门氏菌的致病性具有增强作用。     

鸡白痢沙门菌htrA基因缺失株的构建及其相关生物学特性研究

为研究丝氨酸蛋白酶HtrA对鸡白痢沙门菌在巨噬细胞内生存的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了鸡白痢沙门菌(ATCC19945) htra基因缺失突变株(ATCC19945Δhtra),通过测定其巨噬细胞内存活能力、应激条件实验,探究Htr A蛋白在鸡白痢沙门菌致病过程中的作用。结果显示,缺失株ATCC19945Δhtra与野生型菌株和回复菌株相比,其生长速度、生化特性无明显差异,但其巨噬细胞内存活能力显著降低。应激环境试验结果表明,htra基因缺失后鸡白痢沙门菌对pH、热和H_2O_2氧化应激的敏感性增加,在蛋清中生存能力下降,生物被膜形成能力显著下降。本研究为进一步阐释鸡白痢沙门菌的胞内存活机制、疫苗开发奠定基础。     

肠炎沙门菌非编码小RNA RyhB调控SopE蛋白的表达研究

为研究肠炎沙门菌(SE)50336非编码小RNA(RyhB-1、RyhB-2)对毒力蛋白SopE的调控作用,利用pET原核表达系统表达SE50336 SopE蛋白,免疫BALB/c小鼠获得SopE蛋白的特异性多克隆抗体(多抗)并分析制备血清的特异性。通过Western-blot检测野生株SE50336、RyhB单缺失株(SE50336 ΔryhB-1、SE50336 ΔryhB-2),以及RyhB双缺失株(SE50336 ΔryhB-1ΔryhB-2)中SopE蛋白的表达水平,分析RyhB对SopE的调控作用。结果显示:成功构建重组质粒pET28a-sopE,转化BL21(DE3)感受态细胞后,在IPTG 0.3 mmol/L、温度37℃、转速220 r/min、诱导时间4 h的条件下,SopE蛋白在包涵体中表达;Western-blot结果显示制备的多抗可特异性检测肠炎沙门菌SopE蛋白;与野生株相比,RyhB单缺失株SopE蛋白表达量下降,双缺失株下降更明显,表明RyhB-1和RyhB-2均可上调SopE蛋白的表达。以上结果为进一步研究RyhB-1和RyhB-2对SopE的调控作用机制奠定基础。     

肠炎沙门菌SEF14菌毛与肠上皮细胞IPEC-J2和Caco-2的体外黏附作用研究

为研究肠炎沙门菌SEF14菌毛对肠上皮细胞的黏附作用,本试验利用肠炎沙门菌50336株、突变株50336△sefA、50336△sefD以及互补株50336△sefA (pBRA)、50336△sefD (pACYCD)与肠上皮细胞系细胞(IPEC-J2和Caco-2)进行了黏附作用.结果显示:上述菌株均能与IPEC-J2、Caco-2细胞进行有效黏附,并且随时间延长黏附数量有所增多,相同时间各菌株与IPEC-J2细胞的黏附数量明显多于Caco-2细胞;但细菌和细胞共感染1和4h后,肠炎沙门菌野生株、相应的突变株和互补株与IPEC-J2和Caco-2细胞黏附的数量差别很小,未到达显著差异水平(P＞0.05).结果表明:SEF14菌毛并不特异性介导肠炎沙门菌与肠上皮细胞系IPEC-J2和Caco-2的黏附作用,或者不是介导黏附作用的主要因子.     

WzxE蛋白影响鸡白痢沙门氏菌致病性的研究

wzx/wzy是调控革兰氏阴性菌O抗原合成的主要途径,对细菌的生存、代谢乃至致病性均具有重要作用。为研究该基因簇中wzxE基因对鸡白痢沙门氏菌致病性的影响,本研究通过同源重组方法构建了鸡白痢沙门氏菌参考菌株ATCC19945的wzxE基因缺失菌株(ATCC19945 ΔwzxE),通过生长特性试验、应激试验、细菌蛋清存活能力测定、1日龄雏鸡感染试验对比基因缺失突变株与野生菌株、回补株的生物学特性及分析WzxE蛋白功能。结果显示,wzxE基因缺失并未影响白痢沙门菌的生长特性。应激试验显示,wzxE基因缺失会导致鸡白痢沙门菌在酸性和H_2O_2处理条件下生存能力的显著下降,回补之后得到明显回复。细菌蛋清存活能力检测结果显示,wzxE基因缺失株较野毒株在蛋清内的存活能力下降明显,回补之后存活能力显著增强。1日龄雏鸡感染试验结果显示,鸡白痢沙门菌ATCC19945野生菌株、wzxE基因缺失株和回补株对雏鸡的半数致死量分别为1. 65×10~8cfu、4. 67×10~8cfu和3. 43×10~8cfu,毒力下降不明显。提取鸡白痢沙门菌参考株和缺失株LPS,经SDS-PAGE后银染检测显示,wzxE缺失不影响鸡白痢沙门菌LPS总体成分构成,但影响特定LPS特定寡糖单位的含量。本研究为进一步阐释鸡白痢沙门氏菌细菌毒力的影响因素、疫苗开发奠定基础。     

狐肺炎大肠杆菌ybjX基因缺失株构建及其对小鼠致病性检测

为研究外膜蛋白YbjX对大肠杆菌致病作用的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了狐肺炎大肠杆菌(HBCLE-12)ybjX基因缺失突变株(HBCLEΔybjX),并对其生物学特性进行分析,探索YbjX蛋白在大肠杆菌致病过程中的作用。结果表明,缺失株HBCLEΔybjX与野生型菌株和回补菌株相比,其生长速度、生化特性无明显差异,但其运动能力和血清内存活能力显著下降,对多种抗生素的敏感性明显增强。动物试验表明,ybjX基因缺失突变株对小鼠的致病力显著下降。本研究为进一步阐释大肠杆菌致病机制和疫苗设计奠定基础。     

肠炎沙门菌mreB基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究

MreB蛋白广泛存在于原核生物中,主要生物功能是聚合形成类似于肌动蛋白微丝的纤维,参与细胞形状的维持。为研究肠炎沙门菌的mreB基因缺失对环境压力的应激变化,本研究利用Red重组方法构建肠炎沙门菌SM6株的mreB基因缺失株,同时构建其回补菌株,观察缺失株SM6ΔmreB的形态学变化,分析其对温度缺氧应力、渗透应力以及耐酸性的变化。结果显示,缺失株SM6ΔmreB的菌体变为球状,生长受到抑制;SM6ΔmreB对升温缺氧压力的耐受能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05);在渗透压条件为100mmol/L和200mmol/LNaCl时缺失株的生存能力明显弱于亲本株和回补株(p<0.05);缺失株在强酸环境中的生存能力显著低于亲本株和回补株(p<0.05),而对中性和弱酸性环境的适应能力与亲本株相似。本研究为进一步探究MreB蛋白在沙门菌的致病机制以及菌蜕形成过程中的作用奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌类似crp基因的鉴定及其突变株对雏鸭免疫效果的评价

旨在鉴定鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)中的crp基因,并探究该基因与菌株毒力的关系,了解crp基因突变株的免疫保护效力,为开发新型R.anatipestifer减毒活疫苗奠定基础。采用P-BLAST在R.anatipestifer蛋白质组中搜寻与沙门菌crp基因相似的蛋白基因,发现R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因与沙门菌crp基因相似度为45%;将B739-0373基因克隆到表达载体上,并回补到沙门菌Δcrp突变株中,利用麦芽糖-麦康凯培养基颜色反应对其糖代谢功能进行鉴定,结果发现该基因可完全回补沙门菌自身crp的缺失,推测R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因具有类似沙门菌crp基因的功能;利用同源重组和自杀质粒,构建R.anatipestifer CH-1Δcrp突变株,比较野生及突变株的生长情况和毒力(包括黏附率、侵染率、LD_(50)、在雏鸭肝脑中的定殖能力),结果表明,crp基因的缺失使菌株生长变得缓慢,黏附力(P0.01)和侵染力(P0.001)显著下降,对雏鸭的半数致死量(LD_(50))显著提高,在雏鸭肝脏、脑中定殖能力也显著下降(P0.01);在CH-1Δcrp突变株免疫雏鸭后7,14,21 d,检测雏鸭血清中IgG水平,并以R.anatipestifer野生株对免疫后的雏鸭进行肌注攻毒,观察其临床症状和免疫保护率,发现Δcrp突变株能刺激雏鸭产生高水平的IgG抗体(P0.01),对雏鸭的免疫保护率为100%。综上表明, B739-0373基因鉴定为R.anatipestifer CH-1株的类似crp基因,可全局调控该菌株的生长和毒力;安全剂量的CH-1Δcrp突变株可诱导雏鸭产生较强的免疫保护效力,可作为新型减毒活疫苗的候选菌株。     

FliC蛋白R91S突变对肠炎沙门菌鞭毛形态和小鼠体内定植的影响

沙门菌血清D群3个血清型FliC蛋白氨基酸序列比对分析表明肠炎沙门菌与鸡伤寒沙门菌完全相同，二者与鸡白痢沙门菌存在第91位氨基酸位点差异。本研究旨在探究肠炎沙门菌FliC蛋白第91位精氨酸突变对鞭毛形态、细菌运动性和小鼠体内定植能力的影响。运用λ-Red同源重组技术删除肠炎沙门菌CICC10467 fliC基因，构建系列反式回补突变株，通过体外生长特性试验和Western blot试验分析各菌株生长和FliC蛋白表达情况，运动性试验分析各菌株在半固体琼脂中的泳动能力，电子显微镜观察各菌株鞭毛形态，细胞感染试验分析各菌株的细胞黏附和入侵能力，动物感染试验分析各菌株的组织侵染能力。结果表明，fliC基因缺失株及点突变回补株与野生株的体外生长能力无显著差异（P ≥ 0.05）。fliC基因缺失后肠炎沙门菌不表达鞭毛蛋白，各点突变回补株与野生株鞭毛蛋白表达量无明显差异。FliC蛋白R91S突变导致肠炎沙门菌鞭毛形态由超螺旋形态转变为钝直、柔韧度减弱，运动性显著降低（P<0.000 1），对RAW264.7和HCT116细胞的黏附入侵能力显著下降（P<0.001），对BALB/c小鼠的器官侵染能力显著减弱（P<0.001）。综上表明，FliC蛋白第91位精氨酸对维持细菌运动性至关重要，第91位精氨酸突变能够显著改变肠炎沙门菌鞭毛形态，减弱肠炎沙门菌在小鼠体内定植能力。