用基因枪法将Bt杀虫基因导入水稻愈伤组织的研究

从水稻成熟胚诱导出的愈伤组织经继代培养后可以产生大量的胚性愈伤组织。本研究采用基因枪法转化上述胚性愈伤组织 ,在附加羧苄青霉素 (5 0 0 μg· m L-1)和卡那霉素 (5 0 μg·m L-1)的选择培养基上进行抗性愈伤组织的筛选 ,在附加羧苄青霉素 (5 0 0 μg· m L-1)和卡那霉素 (2 5 μg· m L-1)的分化培养基上诱导抗性芽。GUS酶活性检测和对基因组 DNA作 PCR检测结果均为阳性 ,证明外源目的基因 (Bt)已在寒地水稻抗性愈伤组织中整合并表达。抗性再生植株的 GUS酶活性及 PCR检测正在进行中     

抗生素对沙田柚外植体分化及生长的影响

不同浓度的卡那霉素结合羧苄青霉素、头孢霉素对沙田柚子叶、上胚轴、下胚轴的分化及新梢生长的影响试验结果表明：培养基中卡那霉素浓度超过５０ｍｇ／Ｌ时,不利于诱导产生愈伤组织,也不利于上、下胚轴形成不定芽;卡那霉素浓度大于７ｍｇ／Ｌ时,明显抑制愈伤组织的分化和新梢的生长;羧苄青霉素及头孢霉素浓度为３００－４００ｍｇ／Ｌ时抑菌效果较好,对外植体的生长分化影响亦较小。     

甘蓝型油菜遗传转化体系的研究

以甘蓝型油菜９５０６品系的下胚轴为受体,用根癌农杆菌介导,进行了除草剂Ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ抗性基因（ｐａｔ）的转化试验,得到了抗卡那霉素（Ｋａｎ）选择剂的小植株,并对影响转化的一些因素进行了研究。试验结果表明：Ｋａｎ和羧苄青霉素（Ｃｂ）对芽再生均具有很强的抑制作用;用含２,４－Ｄ的培养基对下胚轴进行预培养和选择培养基中附加ＡｇＮＯ３均能促进转化细胞的生长和芽的再生。转化植株对Ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔ     

美味猕猴桃遗传转化研究初报

以美味猕猴桃东山峰７８－１６的茎段愈伤组织块为受体，根癌农杆茵（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（ｐＢＩ１２１）作介导菌，将愈伤组织块与农杆菌共培，扫描电镜观察农杆菌在愈伤组织块细胞表面上的附着情况；将共培后的愈伤组织块转移到含５０μｇ／ｍＬ的卡那霉素（Ｋａｎ）筛选培养基上筛选，获得抗Ｋａｎ的抗性苗。抗性苗的获得初步证明外源新霉素磷酸转移酶Ⅱ（ＮＰＴⅡ）基因已整合到受体基因组中并得以表达。     

抗生素对高粱愈伤组织诱导和生长的影响

用羧苄青霉素等抗生素进行抑菌试验,以羧苄青霉素和头孢霉素的抑菌效果较好.头孢霉素对高梁愈伤组织的毒性表现出比羧苄青霉素大.浓度低于500 mg/L羧苄青霉素对高梁愈伤组织的生长起促进作用;而分化率随着羧苄青霉素浓度的提高而下降.在农杆菌介导高梁遗传转化时,选用羧苄青霉素是合适的,浓度以250 mg/L为宜.高梁愈伤组织对潮霉素的反应比卡那霉素更敏感,高梁不同基因型愈伤组织对卡那霉素和潮霉素的反应在褐化(死亡)率上表现不同.在以潮霉素作为抗性筛选标记时,选择压以50～75 mg/L为宜.     

苏丹草农杆菌介导法基因转化条件

以苏丹草幼穗诱导产生的胚性愈伤组织为材料,比较了抗生素羧苄青霉素、头孢霉素及筛选剂卡那霉素对愈伤组织生长、绿芽分化和绿苗生长的影响.结果表明:500 mg/L的羧苄青霉素对愈伤组织生长的影响与对照差异不明显,可提高愈伤组织绿苗分化率;500 mg/L的头孢霉素明显抑制愈伤组织的生长,对分化影响不大;愈伤组织生长期筛选剂卡那霉素浓度为75 mg/L时,愈伤组织的褐化率达到100%;愈伤组织分化期,卡那霉素浓度为10 mg/L时,绿芽能分化成幼苗,所有幼苗的心叶白化、生长速度与对照无差异.培养基中添加500 mg/L的羧苄青霉素、经农杆菌侵染和15 mg/L卡那霉素筛选获得再生植株,经PCR检测,初步证明NPTⅡ选择标记基因已整合到部分转化植株的基因组中.     

抗潮霉素(hygromycin)基因(HPT)向水稻愈伤组织的导入研究

用基因枪（ｐａｒｔｉｃｌｅｇｕｎ）将具有抗潮霉素（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）基因（ＨＰＴ）的质粒ＤＮＡ（质粒ＰＳＢＧ１０２）导入到水稻品种延农黑１号的胚性愈伤组织中,共处理了２１４个愈伤组织块,用含潮霉素的ＫＳＰ培养基进行选择培养,筛选出６０个在含潮霉素的选择培养基上生长和增殖良好的愈伤组织块,经ＰＣＲ鉴定,确认其中５４个愈伤组织块中导入进了ＨＰＴ基因     

抗生素对非洲菊试管苗不定芽分化的影响研究

以卡那霉素和潮霉素作为非洲菊抗性植株的选择剂,头孢霉素和羧苄青霉素为抑菌剂,分别采取不同浓度,分析其对非洲菊试管苗不定芽分化的影响.结果表明,25 mg·L-1的卡那霉素或5 mg·L-1的潮霉素可作为非洲菊抗性植株的临界筛选浓度.头孢霉素浓度愈大,213品种不定芽分化频率愈低,当头孢霉素浓度较高(400～500 mg·L-1)时,愈伤组织生长受到抑制;而羧苄青霉素对愈伤组织影响很小,在适宜的浓度下能促进不定芽分化,213品种在羧苄青霉素浓度为200 mg·L-1时,分化频率达到最大值68.8.     

抗生素对剑麻愈伤组织生长和植株再生的影响

研究卡那霉素、潮霉素、头孢霉素和羧苄青霉素对剑麻愈伤组织生长、不定芽分化及生根的影响,并确定抑制农杆菌生长的头孢霉素、羧苄青霉素的质量浓度。结果表明:潮霉素明显抑制剑麻愈伤组织生长和不定芽分化,卡那霉素次之,头孢霉素和羧苄青霉素相对较小;4种抗生素均能抑制剑麻生根,其抑制效果依次为头孢霉素>卡那霉素>羧苄青霉素>潮霉素。头孢霉素和羧苄青霉素的浓度大于200 mg/L时,农杆菌生长完全被抑制。在筛选剑麻转化体时,卡那霉素和潮霉素的使用浓度分别以100、50 mg/L为宜,羧苄青霉素和头孢霉素的使用浓度均为200 mg/L。     

抗生素对甘菊愈伤组织诱导和植株再生的影响

以甘菊叶片为外植体,尝试不同浓度羧苄青霉素(Carb)、卡那霉素(Kan)和潮霉素(Hyg)对甘菊愈伤组织诱导和植株再生的影响.结果表明,潮霉素和卡那霉素都对愈伤组织诱导有抑制作用:对不定芽分化而言,以潮霉素和卡那霉素作为抗性筛选标记时,选择压都以5mg·L-1为宜.羧苄青霉素的抑菌效果较好,质量浓度应在300～500mg·L-1范围;潮霉素3mg·L-1、卡那霉素20mg·L-1为合适的转化植株生根培养的抗生素临界浓度.     

GUS基因转入烟草细胞通过科间细胞共培养在胡萝卜再生植株中的表达

用Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４（含有质粒ｐＢＩ１２１和ｐＡＬ４４０４）介导转化普通烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）的悬浮细胞，获得卡那霉素抗性（ＫｍＲ）材料，其再生植株中表现ＧＵＳ活性。以这一继代半年以上的转基因烟草细胞系为材料，与胡萝卜（Ｄａｕｃｕｓｃａｒｏｔａ）细胞进行科间细胞共培养和低渗活化等处理，在含２００ｍｇ·ｌ－１卡那霉素（Ｋｍ）的培养基上筛选，得到具有ＫｍＲ的胡萝卜田胞系（ｃｅＲ），其再生的胡萝卜植株中也有一部分表现为ＫｍＲ，并在部分植株中检测到ＧＵＳ活性。这一结果表明Ｔ—ＤＮＡ可以通过科间细胞的共培养而从转基因烟草细胞中通过胞间通道转移到胡萝卜细胞中，并在胡萝卜细胞中表达。从这一结果来看，细胞共培养和有关处理的技术（ＡＣＨＴ）可能会成为植物基因转移的新技术。同时，发现共培养可以改进原来不亲和细胞之间的亲和性，这为植物细胞的识别和亲和性研究、亲和性的改善提供了方法和技术。     

葡萄胚珠诱导成苗的研究

通过对葡萄几个品种胚珠愈伤组织的诱导、再分化,以胚状体发生途径实现植株再生。结果表明:以葡萄的胚珠为外植体,在附加不同浓度的2,4-D与6-BA的MS、B5和NN-1969培养基上培养,愈伤组织诱导以NN+2,4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L培养基最佳,诱导率为84.1%,胚性愈伤组织诱导率为79.5%;将胚性愈伤组织置于含NAA0.03mg/L和6-BA0.5mg/L的NN培养基中,胚状体诱导率为6%～15%;胚状体在无激素MS培养基中的成苗率为0%～20%。     

农杆菌介导遗传转化获得转CP4基因籼稻的研究

  目的  建立籼稻‘中恢161’Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的转化体系。  方法  以籼稻‘中恢161’的成熟胚为材料,设置了5个草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L?1)进行胚性愈伤组织的草甘膦敏感性试验。利用农杆菌介导法,将草甘膦抗性基因CP4-EPSPS导入‘中恢161’的胚性愈伤组织中,转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L?1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选。抗性愈伤组织进一步分化、成苗。  结果  草甘膦质量浓度为300~400 mg·L?1时,愈伤组织褐化率约50%,具有很好的选择效果。经统计,300、350和400 mg·L?1草甘膦抗性筛选后,愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%,抗性愈伤组织的分化率为46.43%,成苗率为32.84%。共获得67株再生小苗,经PCR检测,43株成功转入CP4基因,再生植株阳性率为64.18%。  结论  建立了‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。图5参20     

油菜遗传转化体系中卡那霉素浓度的筛选及抑菌剂的选择

利用根癌农杆菌(Agribacteriumtumefaciens)介导的下胚轴转化方法,将一抗病基因转化甘蓝型油菜.在遗传转化体系的建立过程中进行了卡那霉素(Km)浓度的筛选及抑菌剂的选择,以确定合适的选择压力及适宜的杀菌剂.试验结果表明:选择培养基中附加25 mg/L Km较适宜;抗性苗筛选过程中羧苄青霉素(Cb)对芽苗分化影响较小,且在500 mg/L时能够很好的抑制农杆菌的过度生长.生根培养基中添加头孢霉素(Cef)和Cb对根分化的影响没有明显差异.     

橡胶树热研8—79原生质体培养再生植株

【目的】优化橡胶树热研8-79原生质体分离和培养条件,建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系,为橡胶树体细胞杂交育种奠定基础。【方法】以橡胶树热研8-79花药愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为试验材料,设计不同酶组合、酶解时间和悬浮细胞继代时间进行原生质体分离,采用不同培养基、看护细胞浓度和接种密度进行原生质体培养,对原生质体分裂发育的小愈伤组织进行体细胞胚诱导及植株再生培养,统计原生质体的产量、分裂频率、体胚数及体胚萌发率。【结果】酶组合为纤维素酶1.50%＋果胶酶0.15%＋离析酶0.50%、酶解时间为12 h时,继代培养第5 d的胚性悬浮细胞达最高产量（3.6 ×107个/mL PCV）;用酶解细胞和看护细胞继代培养基分别作为原生质体液体培养基和看护培养基,比使用KPR培养基更有利于原生质体的分裂,当看护细胞浓度为5%、接种密度为5 ×105个/mL时原生质体的分裂频率最高,达54%。原生质体持续分裂形成肉眼可见的小愈伤组织增殖后经体胚发生途径发育成完整的小植株。【结论】通过优化橡胶树热研8-79胚性悬浮细胞原生质体分离的酶组合、酶解时间、继代培养时间及看护培养过程中培养基组成、看护细胞浓度和接种密度等影响因素,可以建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系。     

荔枝愈伤组织诱导及其体细胞胚胎发生研究初报

分别取元红荔枝盛花后45d未败育的幼胚、一个月龄的实生苗叶片、成龄树叶片、未受精子房接种在愈伤组织诱导培养基上,均能诱导出愈伤组织,但仅有幼胚能诱导出胚性愈伤组织。幼胚在含5% 蔗糖的MS基本培养基附加2,4-D2mg/L+水解乳蛋白500mg/L的培养基上诱导率最高。幼胚愈伤组织在含5% 蔗糖的基本培养基附加10% 椰乳的培养基上,白色胚状体发生率最高。胚状体易提前萌发,仅抽生根不抽生茎。健壮的未生根胚状体在含5% 蔗糖的培养基附加BA1mg/L的培养基上生根率最低,为理想的萌发培养基。随着BA浓度的降低,生根率提高,呈负相关。同浓度BA抑制生根的效果好于KT。在萌发培养基上生长一段时期后,少数较成熟的胚状体抽生出茎叶,长成完整植株。     

黄独胚性愈伤组织冻后黑暗培养及其再生植株半薄切片观察

以黄独胚性愈伤组织为材料,对黄独胚性愈伤组织冻后黑暗培养的时间进行探讨,并对冻后黑暗培养胚性愈伤组织的显微结构及其再生植株进行半薄切片观察。结果表明,包埋玻璃化法超低温保存后,黑暗培养1~5 d,黄独胚性愈伤组织的冻后成活率随着时间的延长而增加,超过5 d,成活率显著下降。半薄切片观察结果表明,冻后黄独胚性愈伤组织直接置于光周期下培养,会造成细胞排列疏松,局部出现较大的细胞空隙;而经黑暗培养后再置于光周期下培养,细胞排列较为紧密,细胞空隙较小。经半薄切片观察,黄独冻后黑暗培养胚性愈伤组织再生植株与常温继代再生植株相比较,根、茎、叶结构无显著差异,叶肉细胞的平均叶绿体数量也无显著差异。因此,冻后黑暗培养一定程度上保证了胚性愈伤组织细胞结构的完整性,且其再生植株无形态学变异。     

冬小麦遗传再生体系及根癌农杆菌介导的转化研究

以临优145的幼胚为外植体诱导植株再生,并进行农杆菌转化研究.以冬小麦品种临优145的幼胚为外植体,消毒后用解剖刀挑取幼胚,盾片朝上接种于MS+2,4-D 2 mg/L+肌醇100 mg/L+MES 400 mg/L+CH 100 mg/L+40 g/L麦芽糖+8 g/L琼脂的培养基中诱导愈伤组织,每2周继代一次,将诱导出的淡黄色、颗粒状Ⅱ型胚性愈伤组织接种于分化培养基(MS+ZT 1 mg/L+IAA 1mg/L+MES 400 mg/L+CH 100 mg/L+麦芽糖40 g/L+gelrite 2.6 g/L,pH 5.8)上培养2-3周,然后转接到再生培养基(1/10 MS+NAA 0.5mg/L+KT0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+gelrite 2.6 g/L,pH 5.8)中进行再生成苗.接种1229块幼胚,得到987块愈伤组织,Hyg抗性愈伤组织123块,抗性再生植株34株.在建立了再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将GUS基因导入幼胚愈伤组织,抗性植株的PCR检测呈阳性.X-gluc染色表明,少部分愈伤组织出现肉眼可见的蓝色晕斑,说明GUS基因已经在小麦幼胚愈伤组织中表达.     

巴东红三叶胚性细胞悬浮系的建立

以红三叶(Trifolium pratense)野生品种巴东红三叶的叶片为外植体,在MB-1至MB-9的固体培养基上诱导愈伤组织,筛选出最佳培养基MB-9.愈伤组织形成以后,均经MB-9固体培养基上继代培养3～4次后,获得胚性愈伤组织,然后转至改良的MB-9液体培养基中,经强化培养两个月后,获得胚性细胞悬浮系.结果表明,缩短换液时间,每隔3～4d换液1次,可加快胚性细胞悬浮系的建立.